家蚕丝产量性状分子调控机理的研究及蚕丝性能的改造

摘要

家蚕被驯化来生产蚕丝已经有近5千年的历史。近年来，随着基因组测序的完善，家蚕已经成为一种重要的模式昆虫，在具有可观的经济价值的同时，还具有重要的科学研究价值。蚕丝是一种良好的生物材料，不仅可用于制作衣物棉被、饰品等一些高档消费品，还能够用作医学缝合线等医用耗材。与人类的高血压、糖尿病、肥胖、水稻产量、大豆油含量以及奶牛产奶量这些复杂性状相似，丝蛋白的合成和分泌是一个由多基因决定的典型的复杂性状。确定一个复杂性状的遗传机制是一项艰巨的工作，因为这些表型的变化常常是由环境与基因之间的互作而引起的。家蚕与生俱来的优越条件，如生命周期短，养殖密度大，安全性高，室内饲养条件易于控制等，使其成为研究复杂性状分子机制的理想模型。同时由于作为生物材料在医疗事业上的需要，对蚕丝性能进行改造也是一项非常有意义的工作。本文针对这些科学问题进行了系列的研究探索，取得的主要研究结果如下:
　　1、基于定量蛋白质组学和转录组学分析结果对家蚕丝产量性状分子调控机制的解析
　　本研究采用基于SDS-PAGE和Gel-free的蛋白质组学技术以及转录组测序技术，以茧丝产量降低的突变品种ZB的后部丝腺为材料，研究蚕丝产量的分子机制。结果表明，在五龄第三天丝蛋白合成与分泌达到高峰的时期，相对于转基因家蚕供体Lan10品种，突变品种ZB的核糖体蛋白在蛋白质和转录本水平上的表达量都降低，翻译相关延伸因子转录本水平降低，重要的丝蛋白成分表达量也降低，相反，蛋白酶体关联的pathway增强，包括氧化磷酸化、糖酵解和三羧酸循环等能量代谢关联的pathway也增强。这些结果说明，ZB品系丝产量的降低可能主要是丝蛋白合成能力降低、蛋白质降解提前以及能量的非有效利用造成的。研究结果为今后培育家蚕丝高产品种奠定了分子基础。
　　2、基于iTRAQ的蛋白质组学和RNA-sequencing转录组学分析结果对蚕丝产量性状分子调控机制的解析
　　研究采用了同重同位素相对与绝对定量(iTRAQ)蛋白质组学技术和转录组分析中的新外显子的数据信息来进一步研究ZB家蚕品种家蚕丝产量性状的分子调控机理。采用后部丝腺为材料，研究新鉴定了139个蛋白质和630个转录本。以转基因家蚕供体Lan10品种为对照，研究结果丰富了家蚕后部丝腺的蛋白质和转录本的信息。鉴定到的差异蛋白为89个，其中23个显著上调，66个显著下调。鉴定到的差异转录本为788个，其中779个上调，9个下调。研究结果进一步证实ZB品系能量的空耗、蛋白质翻译效率降低以及蛋白质降解水平的提高是其丝蛋白低的关键因素。在此基础上，本研究还进一步发现，转录功能的降低、蛋白质折叠和转运出错、丝蛋白主要成分表达量的降低以及后部丝腺器官生长发育的减缓可能是导致ZB品系丝蛋白产量降低的另外几个重要原因。
　　3、利用转基因家蚕生产钙离子结合蛋白活性生物材料的研究
　　家蚕丝蛋白与生俱来的一些优越性能使其非常适合作为多种生物材料。在本研究中，利用家蚕后部丝腺生物反应器表达了具有钙离子结合活性的珍珠母贝基质蛋白序列[(AGSGAG)6ASEYDYDDDSDDDDEWD]2，获得了复合蚕丝。对此蚕丝的钙离子结合活性和矿化作用的体外检测结果表明，转基因家蚕复合蚕丝的钙离子结合活性比非转基因对照品系显著增强。这种具有钙离子结合活性的蚕丝的生产，提供了蚕丝作为一种生物材料在医药领域应用的可能性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 家蚕产丝量复杂性状分子调控机制的研究进展

1．1．1 家蚕丝产量性状的研究概况

1．1．2 遗传学手段研究复杂性状的发展概况

1．2 蛋白质组学技术以及转录组学技术的发展

1．2．1 蛋白质组学技术的发展

1．2．2 转录组学技术的发展

1．3 丝品质改造的研究概况

1．4 本研究问题的提出以及其研究目的和意义

1．5 技术路线

第二章 利用定量蛋白质组学和转录组学研究家蚕丝产量性状的分子调控机制

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 蛋白质提取

2．2．4 SDS-PAGE和胶内消化

2．2．5 非胶内消化

2．2．7 蛋白鉴定

2．2．8 利用所获得的MS数据分析蛋白丰度差异和数据库搜索

2．2．9 cDNA的制备

2．2．10 转录组测序和数据分析

2．2．11 后部丝腺总RNA抽提和荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

2．2．12 插入位点分析

2．2．13 生物信息学分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 转基因家蚕和对照品系之间的差异

2．3．2 基于SDS-PAGE和Gel-free蛋白质组学的蛋白鉴定

2．3．3 转录本鉴定结果

2．3．4 后部丝腺蛋白质组和转录组的比较分析

2．3．5 与丝蛋白合成与分泌相关的蛋白质和转录本的差异比较

2．4 结论

第三章 利用基于iTRAQ技术的蛋白质组学和基于RNA测序的转录组学来研究家蚕丝产量性状的分子调控机制

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要试剂

3．2．3 家蚕饲养和材料提取

3．2．4 蛋白质提取和消化

3．2．5 iTRAQ分析

3．2．6 蛋白质鉴定和定量

3．2．7 Western Blot分析

3．2．8 转录组分析

3．2．9 qRT-PCR分析

3．3 结果

3．3．1 ZB和Lan10品系之间蛋白质丰度的改变

3．3．2 差异性表达的蛋白质的GO分析

3．3．3 差异性表达蛋白的生物学网络(BIN)分析

3．3．4 ZB和Lan10品系间差异性表达的转录本

3．3．5 差异性表达转录本的GO分析

3．3．7 mRNA表达和蛋白质丰度之间的关系

3．3．8 蛋白质表达丰度的验证

3．3．9 差异性表达的蛋白质和转录本与家蚕丝产量之间的关系

3．4 讨论

3．4．1 能量代谢对于丝产量至关重要

3．4．2 下调的核糖体蛋白丰度影响翻译过程

3．4．3 与蛋白质的转运和加工相关的蛋白表达量降低

3．4．4 后部丝腺生长和发育的降低影响了丝蛋白的产量

3．4．5 核糖体和蛋白转运通道之间的反应表明了系统范围内的功能下调

3．4．6 与丝产量相关的重要的功能分类

3．4．7 下调的核糖体pathway和上调的代谢影响了丝产量

3．4．8 新鉴定出的转录本提升了对丝产量分子机制的理解

3．4．9 与丝蛋白合成的差异表达的蛋白质和转录本的丰度高度一致

3．5 结论

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂

4．2．3 钙离子结合蛋白表达载体的构建

4．2．4 胚胎注射以及阳性个体筛选

4．2．5 插入位点的反向PCR分析

4．2．6 Western Blot分析

4．2．7 转基因家蚕丝蛋白的钙结合活性实验

4．2．8 转基因家蚕蚕丝的力学性能和热性能的测试

4．3 结果

4．3．1 转基因家蚕的获得

4．3．2 转基因家蚕插入位点分析

3．3 Western Blot鉴定结果

4．3．4 MS／MS鉴定结果

4．3．5 转基因丝蛋白的钙离子结合活性分析

4．3．6 转基因丝蛋白的力学性能和热学性能

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 全文总结及创新点

攻读学位期间发表的学术论文

获得的荣誉

申请的专利

致谢

参考文献

附表