组蛋白甲基转移酶SETD2调控干扰素介导的抗病毒效应的分子机制研究

摘要

Ⅰ型干扰素(TypeⅠ Interferon，IFN-Ⅰ)是一类由机体产生的具有抗病毒功能的细胞因子，它通过激活细胞内JAK-STAT信号通路诱导一系列干扰素诱导基因(IFN-stimulated gene，ISG)的表达，并通过这些基因直接发挥抑制病毒生命周期、激活免疫细胞对感染病毒的细胞进行杀伤等作用，为机体建立起抗病毒感染的第一道防线。相反，干扰素信号调节的异常与感染性疾病和过度的炎症反应的发生密切相关。因此，机体内的干扰素信号需要受到严格且精确的调控以确保其在实现抗病毒作用的同时，避免因为信号异常产生细胞毒性，破坏机体稳态。干扰素信号的调控是细胞内多个水平的分子调控间相互协同作用的结果。近年来，表观遗传调控与非经典的蛋白质翻译后修饰在该信号传导过程中的作用被逐渐揭示，然而它们调控干扰素介导的抗病毒免疫应答的分子机制目前尚不清楚。
　　为了研究干扰素抗病毒免疫应答的表观遗传调控及其机制，本研究首先以稳定表达HBV的人肝癌细胞株HepG2.2.15为模型，探索调控IFN抗病毒效应的表观遗传修饰酶。我们针对目前已经报道的编码所有表观遗传修饰的基因（共711个基因）进行高通量的RNA干扰筛选，并通过初步筛选和二次验证，发现组蛋白甲基转移酶SETD2的干扰显著减弱了IFNα抗HBV的效应。即SETD2的干扰使 IFNα作用下HepG2.2.15细胞内HBV拷贝数增加，HBsAg的分泌量增多。此外，在HBV急性感染的小鼠模型实验中发现，肝脏特异性敲除Setd2小鼠的血清中具有更高的HBsAg的分泌、其肝脏组织有更多的HBcAg的表达。进一步研究发现，在不携带病毒的肝细胞系中敲除或敲低SETD2显著地减弱了IFNα诱导的STAT1磷酸化，并广泛地降低了ISG表达和IFNα抑制病毒（如HBV、VSV）复制的效应。随后进一步证明SETD2也能够促进Ⅱ型与Ⅲ型IFN的信号转导。上述结果表明，SETD2能够通过正向调控IFN信号转导，促进IFN的抗病毒效应。
　　接着，我们对SETD2介导干扰素的抗病毒效应的分子机制展开研究。通过体内和体外的蛋白互作分析发现，含有SET结构域的SETD2截短体片段可以与STAT1发生直接的相互作用，并通过SET结构域发挥其甲基转移酶活性，催化STAT1的第525位赖氨酸发生单甲基化修饰(STAT1-K525me1)。同时，STAT1K525的单甲基化修饰促进了IFNα诱导的STAT1磷酸化激活，进而激活下游ISG的表达。此外，SETD2还可以选择性的催化一些ISG（如ISG15等）远端启动子区发生组蛋白H3K36me3的修饰从而直接促进这些基因转录活化，上调它们的表达。我们还通过RNA-seq鉴定到一个新的ISG——RARRES3，初步研究显示该基因具有显著的抗HBV复制的功能。总的来说，SETD2通过蛋白质翻译后修饰和表观遗传修饰这两种重要的调节方式正向调控IFN下游的信号传导，从而增强IFN介导的抗病毒效应。
　　综上所述，本研究发现了甲基转移酶SETD2正向调控IFN信号的新功能，鉴定出IFN信号关键转录因子STAT1上一个能够增加其磷酸化激活的新的甲基化修饰位点——K525，同时揭示了SETD2通过催化STAT1的甲基化修饰以及ISG基因远端启动子区的H3K36me3修饰以增强IFN信号以及抗病毒活性的新机制，从而进一步完善了IFN信号的调控网络，并为临床上研发新的抗病毒药物提供新的潜在的研究靶标。

目录

声明

致谢

序言

摘要

主要缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 高通量筛选体系的建立

3．2 高通量筛选调节IFNα抗HBV感染的表观修饰酶

3．3 SETD2促进IFNα的抗HBV效应依赖其含有SET结构域的肽段

3．4 SETD2通过其甲基转移酶活性促进IFNα下游STAT1的磷酸化以及ISG的表达

3．5 SETD2调节IFNα的抗病毒反应具有广泛性

3．6 SETD2促进三种亚型的IFN信号下游STAT1的磷酸化以及ISG的表达

3．7 SETD2通过其甲基转移酶活性促进STAT1发生单甲基化修饰

3．8 SETD2通过SET结构域与STAT1直接相互作用

3．9 STAT1赖氨酸甲基化修饰位点的鉴定

3．10 STAT1的磷酸化活化以及转录活性依赖于其第525位赖氨酸(K525)的甲基化修饰

3．11 SETD2催化STAT1发生K525位点的甲基化修饰

3．12 SETD2选择性地催化部分ISGs基因区发生H3K36me3修饰从而促进转录

3．13 RARRES3是一种具有抑制HBV复制功能新的ISG

4 讨论

5 结论

6 参考文献

7 附录

综述

作者简历