印染废水与生活污水中抗生素抗性基因分布差异及机理研究

摘要

抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes，ARGs)污染已经成为全球性的环境问题，污水处理系统由于其中存在大量的ARGs和ARB而备受关注。已有研究证明，杀菌剂、表面活性剂以及抗生素等有机物会导致水体中细菌产生共同耐药性或交叉耐药性，促进ARGs传播扩散。印染废水具有排放量大、有机污染物浓度高、成分复杂、微生物毒性大等特点，其中含有的苯系物、多环芳烃、季铵化合物等能够导致基因突变或破坏细胞膜结构，可能对微生物耐药性的产生和传播有一定促进作用，但印染废水中ARGs的分布及传播机理一直未被报道。
　　本研究利用高通量荧光定量PCR技术和16S rRNA基因测序技术，研究同一城市内的生活污水处理系统和印染生活混合污水（以下简称混合污水）处理系统中的ARGs和可移动基因元件(Mobile genetic elements，MGEs)的季节变化以及不同系统中ARGs分布的差异性，分析微生物群落结构特征以探究菌群结构与ARGs的内在关联。同时，通过抗性质粒接合转移实验研究印染废水有机污染物对基因水平转移的影响，探求印染废水有机污染物在ARGs传播扩散过程中的作用与机理。论文的研究结果如下:
　　(1)不同污水处理厂的进水和剩余污泥中的ARGs的种类和数量均无明显季节性波动，出水中冬季ARGs总绝对丰度较夏季和秋季有所下降;LEfSe分析得到夏季污水中有11种ARGs丰度较高(aadA5-02，aac-6-Ⅱ，cmlA1-01，cmlA1-02,blaOXA10-02,aadA-02,tetX,aadA1,ereA,qacE△1-01,blaTEM)，冬季样品有10种ARGs丰度较高(tet-32，tetA-02，aacC2，vanC-03，aac-6-I1，tetE，ermB，mefA，tnpA-07，sul2)。细菌群落在科（或属）水平上，污水处理厂夏季的优势菌为Synechococcus和vadinCA02，冬季的优势菌为Trichococcus，Lactococcus，Pelosinus，Janthinobacterium，Nitrosomonadaceae，Sterolibacterium;同一季节的优势菌与该季节高丰度ARGs相关性较好，季节变化中ARGs分布差异可能是由于细菌群落季节性变化造成的。
　　(2)混合污水进水中ARGs标准化拷贝数高于生活污水，经过处理，混合污水出水中ARGs的标准化拷贝数仍高于生活污水出水。混合前的印染废水中含有高丰度的MGEs，其标准化拷贝数是其它样品的3.7-13.1倍，Spearman相关性分析得到MGEs与ARGs总标准化拷贝数呈显著正相关(R=0.933，p=0.001)，与氨基糖苷类ARGs相关性也十分显著(R=0.800，p=0.010);聚类分析表明多数MGEs属于持久性基因，污水处理工艺对其去除效果有限。因此，印染废水中高丰度的MGEs可能促进了ARGs的传播而导致混合污水中的ARGs丰度增加。
　　(3)印染废水中存在29种特有的高丰度抗性基因，其中有12种为β-内酰胺类，9种为其他/外排泵类，7种为FCA类，1种为氨基糖苷类。细菌群落结构分析表明，厚壁菌与7种上述基因(acrR-01，acrB-01，rarD-03，blaSHV-01，blaSHV-02，bacA-02，ampC-07)存在相关性，厚壁菌门中的链球菌属相关性最好，因此链球菌可能是这些ARGs的宿主细菌。
　　(4)接合转移实验确证，印染废水中的邻二甲苯，乙苯，三聚甲醛，苯乙烯，2，4-二氯苯胺和孔雀石绿能够促进RP4质粒在大肠杆菌种内的接合转移，接合转移效率是自然条件下的4.3-219倍，其中接合转移效率最高的是邻二甲苯，最低的是孔雀石绿。苯乙烯，2，4-二氯苯胺和孔雀石绿的接合转移效率均出现峰值或平台期，底物浓度升高到一定程度会导致受体菌与接合子不同程度的死亡，导致接合转移效率降低，因此底物的浓度和毒性均能影响接合转移效率。

目录

声明

致谢

前言

摘要

第一章 文献综述

1．1 抗生素抗性基因研究现状

1．1．1 抗生素抗性基因问题的由来及传播

1．1．2 水体环境中抗性细菌和抗性基因的行为

1．2 有机物对抗生素抗性基因传播的影响

1．2．1 抗生素

1．2．2 消毒副产物

1．2．3 季铵化合物

1．2．4 离子液体

1．3 印染废水的排放现状及主要污染物

1．3．1 印染废水排放现状

1．3．2 印染废水主要污染物

1．4 基因检测技术发展

1．5 研究目的、研究内容和技术路线

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

第二章 污水处理厂抗生素抗性基因季节变化特征

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 样品预处理

2．2．3 DNA提取与测定

2．2．4 高通量定量PCR

2．2．5 16S rRNA基因高通量测序

2．2．6 数据处理及分析方法

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 抗生素抗性基因丰度的季节变化

2．3．2 细菌群落结构的季节变化

2．3．3 细菌群落与抗性基因相关性分析

2．4 本章小结

第三章 生活污水与印染废水中抗性基因与微生物群落行为特征

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 样品采集

3．2．2 样品预处理

3．2．3 实验方法

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 生活污水和印染生活混合污水中抗生素抗性基因行为特征

3．3．2 生活污水和印染生活混合污水中微生物群落的行为特征

3．3．3 抗生素抗性基因与微生物相关性分析

3．4 本章小结

第四章 印染废水有机污染物对抗性基因传播机理研究

4．1 前言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 印染废水样品检测

4．2．2 接合转移实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 印染废水中有机污染物定性分析

4．3．2 有机物对接合转移的影响

4．4 本章小结

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录

攻读硕士期间学术成果