上皮性卵巢癌细胞经Notch1途径影响树突状前体细胞亚群分化和功能的研究

摘要

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian carcinoma，EOC)是致死率最高的妇科肿瘤。据报道2014年美国约有22000妇女被诊断为卵巢癌，其中超过14000妇女死亡。尽管大多数病人能在初次治疗结束后获得临床完全缓解，但卵巢癌的预后仍不容乐观，5年生存率仅30-40％。目前认为卵巢癌的高复发率、高转移率及高死亡率，与肿瘤局部微环境免疫缺陷密切相关。导致EOC免疫缺陷的原因很多，包括肿瘤局部微环境中免疫抑制细胞因子增多，树突状细胞(dentritic cells，DC)的功能缺陷，辅助性T细胞(helper T cell，Th)中Th1/Th2平衡漂移，有效的T细胞免疫应答受抑制等等，最终导致肿瘤细胞的免疫逃逸，促进肿瘤的进展。
　　树突状细胞(dentritic cells，DC)是机体抗肿瘤免疫中的关键细胞，以往及我们前期的研究已证实DC亚群分化及功能的异常是肿瘤逃逸的重要原因。DC作为生物体内功能最强大的专职抗原提呈细胞，根据来源可分为髓系来源的DC(myeloid DC，mDC))和淋巴系来源的DC(lymphoid DC)，又称为浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DC，pDC)两个亚群。成熟的mDC高表达主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类、Ⅱ类分子、协同刺激分子等，分泌白介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等细胞因子，促进Th1反应，诱导免疫激活。成熟的pDC高表达IL-3Ra(CD123)、Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)，分泌大量Ⅰ型干扰素，促进Th2反应，诱导免疫耐受。在肿瘤中主要表现为成熟DC的下降具有免疫激活功能的mDC的数量减少或功能缺陷以及具有免疫抑制功能的pDC的数量增加或功能亢进。我们前期的研究从CD34+造血干细胞中分离得到DC的前体细胞Lin-CD45RA-DC，并发现在SKOV3培养上清的作用下该DC前体细胞(Lin-CD45RA-DC)向pDC分化增加，向mDC的分化减少，进而推测这种分化的异常可能与EOC的免疫逃逸及肿瘤的发生相关，但具体机制尚不清楚(本部分内容已经发表在Gynecol Oncol.2009;112(1):199-204)。
　　Notch蛋白(Notch1-4)由一组高度保守的跨膜受体蛋白，由Notch基因编码，被认为可以决定细胞命运，其中Notch1起主要作用。目前有较多的文献证实Notch1通路与卵巢癌的发生发展密切相关。Chen C等报道Notch1受体mRNA的表达与卵巢癌的预后密切相关。Feng Z等报道Notch1受体参与卵巢癌微环境中的免疫逃逸。此外有关Notch1受体与DC的研究发现在DC细胞中存在Notch1受体及其配体的表达，Notch1信号途径参与调节DC的分化，Hoshino N等报道活化Notch信号通路可以促进外周血单核细胞向DC及朗格汉斯细胞分化，De Smedt等报道用γ酶抑制剂阻断Notch1信号通路后可以促进向非T细胞包括单核细胞或树突状细胞分化。由此，我们推测EOC细胞产生的各种因子可能通过Notch1信号通路的介导，影响了DC前体细胞的正常分化，进而免疫逃逸，促进了EOC的产生和进展。
　　本研究在前期研究的基础上，利用前期已建立的体外DC分化培养模型，首先确定Notch1受体和配体在DC前体细胞(Lin-CD45RA-DC)中的表达;其次研究EOC培养上清对DC前体细胞(Lin-CD45RA-DC)分化及功能的影响;再分别用r-分泌酶抑制剂DAPT及短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）下调DC前体细胞(Lin-CD45RA-DC)中Notch1受体的表达，以证实Notch1信号通路对DC前体细胞(Lin-CD45RA-DC)分化及功能的影响;最后比较Notch1受体抑制前后EOC培养上清对Lin-CD45RA-DC前体细胞分化及功能的影响。旨在初步探索EOC微环境参与调节DC前体分化及功能异常的可能机制，有助于理解EOC免疫逃逸机制，并为EOC的免疫治疗提供新的靶点。
　　第一部分 树突状前体细胞中Notch1受体及配体的表达
　　目的:
　　检测并验证Lin-CD45RA-DC前体细胞中Notch1受体及配体的表达。
　　材料与方法:
　　1.足月分娩产妇的脐血中提取CD34+造血干细胞，扩增后并用免疫磁珠分选，获得Lin-CD45RA-DC前体细胞，并建立体外DC分化培养模型，;
　　2.采用Real time RT-PCR检测Lin-CD45RA-DC前体细胞中Notch1受体及配体(Jagged1、Jagged2、Delta1)mRNA的表达;
　　结果:
　　1.在Lin-CD45RA-DC前体细胞中，检测到Notch1受体及其配体Jagged1、Jagged2、Delta1的mRNA的表达;
　　2.Notch1受体，Jagged1高表达，Jagged2，Delta1低表达。
　　结论:
　　Notch1和Jagged1在Lin-CD45RA-DC前体细胞中表达相对较高，而Jagged2和Delta1则相对较低，提示Notch1和Jagged1可能在Lin-CD45RA-DC前体细胞中发挥主要作用。
　　第二部分 上皮性卵巢癌细胞经Notch1途径影响树突状前体细胞的分化
　　目的:
　　1.研究SKOV3培养上清对Lin-CD45RA-DC前体细胞分化的影响;
　　2.研究Notch1受体抑制对Lin-CD45RA-DC前体细胞分化的影响;
　　3.研究Notch1受体抑制前后SKOV3培养上清对Lin-CD45RA-DC前体细胞分化的影响;
　　材料与方法:
　　1.利用第一部分中建立的体外DC分化培养模型，加入SKOV3培养上清，流式细胞仪检测各实验组mDC及pDC的变化，比较SKOV3培养上清加入前后对Lin-CD45RA-DC前体细胞分化的影响;
　　2.分别采用Notch1-shRNA慢病毒或DAPT下调Lin-CD45RA-DC前体细胞Notch1受体的表达，用流式细胞仪检测各实验组mDC及pDC的变化，比较Notch1受体抑制前后对Lin-CD45RA-DC前体细胞分化的影响;
　　3.利用2中Notch1受体抑制的Lin-CD45RA-DC前体细胞，加入SKOV3培养上清，用流式细胞仪检测各实验组mDC及pDC的变化，比较Notch1受体抑制前后SKOV3培养上清对Lin-CD45RA-DC前体细胞分化的影响。
　　结果:
　　1.SKOV3培养上清使Lin-CD45RA-DC前体细胞向mDCs的分化减少(p=0.011)，向pDCs的分化增多(p=0.006);
　　2.Notch1受体表达抑制可以影响Lin-CD45RA-DC前体细胞的分化，向mDC的变化增多（DAPT组:P＞0.05;shRNA组:p=0.007），向pDCs的分化减少(p=0.015，p=0.007);
　　3.Notch1受体表达抑制可以部分逆转SKOV3对Lin-CD45RA-DC前体细胞向pDC的分化效应(p=0.02，p=0.02)，但不改变其对mDC的分化效应(p=0.25，p=0.07);
　　结论:
　　SKOV3上清可能通过Notch1信号通路影响Lin-CD45RA-DC前体细胞向pDC的分化。
　　第三部分 上皮性卵巢癌细胞经Notch1途径影响树突状细胞的功能
　　目的:
　　证实SKOV3培养上清经Notch1途径影响树突状细胞的功能。
　　材料与方法:
　　1.利用第一部分中建立的体外DC分化培养模型，加入SKOV3培养上清，ELISA法比较各组分泌IL-12值的变化，比较SKOV3培养上清加入前后对DC功能的影响;
　　2.利用第二部分中Notch1下调表达的Lin-CD45RA-DC前体细胞，ELISA法比较各组分泌IL-12值的变化，比较Notch1受体抑制前后对DC功能的影响;
　　3.利用第二部分中Notch1下调表达的Lin-CD45RA-DC前体细胞，加入SKOV3培养上清，ELISA法比较各组分泌IL-12值的变化，比较Notch1受体抑制前后SKOV3培养上清对DC功能的影响。
　　结果:
　　1.SKOV3培养上清可以促进DC细胞IL-12分泌减少(p=0.001);
　　2.Notch1受体表达抑制可以促进DC细胞IL-12分泌增多(p=0.0002，p=0.0002);
　　3.Notch1受体表达抑制可以部分逆转SKOV3所致的DC分泌IL-12的效应(p=0.02，p=0.01);
　　结论:
　　SKOV3上清可能通过Notch1信号通路影响树突状细胞分泌IL-12。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 前言

参考文献

2 第一部分 树突状前体细胞中Notch1受体及配体的表达

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

参考文献

3 第二部分 上皮性卵巢癌细胞经Notch1途径影响树突状前体细胞的分化

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

参考文献

4 第三部分 上皮性卵巢癌细胞经Notch1途径影响树突状细胞的功能

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 结论

参考文献

综述一 Notch信号通路与卵巢癌的研究进展

综述二 免疫治疗在卵巢癌中的应用进展

作者在读期间科研成果