聚羟基丁酸酯的微生物合成代谢及其在土壤中的降解研究

摘要

聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，简称PHB)是由多种微生物合成的聚酯类物质，作为碳源和能源的贮存物质存在于细胞中。PHB的物理性质与传统塑料类似，是一种可生物降解的环境友好型材料。除此之外，PHB还具有生物相容性、良好的光学活性、压电性等优良性能，是一种重要的化工产品。作为可生物降解的环境友好型的材料，PHB在医疗、塑料包装、农膜地膜等领域被广泛应用。在土壤中，PHB最终被降解成为二氧化碳和水，不会残留，不会对土壤造成污染，关于PHB的研究对于缓解“白色污染”以及资源的可持续利用具有重要的意义。
　　本研究首先通过尼罗红染色、透射电镜等方法对Massilia sp.WG5菌株合成PHB的能力进行了定性确定，探究了该菌株产PHB的最佳条件，并基于全基因组数据分析探究了菌株PHB代谢相关的基因及代谢通路，为其它菌株PHB代谢通路研究以及构造高产PHB的工程菌提供思路。然后，通过FTIR、NMR、GPC等手段对该菌株合成的PHB进行了性能表征。最后，对PHB在土壤中的降解进行探究，为评价其农业应用及环境效应提供指导。研究主要得到了以下研究结果:
　　(1)通过透射电子显微镜(TEM)、尼罗红染色、双光子激光共聚焦显微镜观察与气相色谱法相结合定性判定了菌株产生的物质为PHB。透射电镜下，PHB呈明显区别于周围细胞质的白色椭球型。尼罗红染色后，产PHB菌株在荧光显微镜下观测会发出黄色至橙红色的荧光。在固定激发波长为488nm的条件下，利用荧光分光光度计扫描最大发射波长，PHB合成菌体的最大发射波长出现在590nm处。
　　(2)菌株WG5在含5g·L-1葡萄糖的矿质培养基中28℃培养48h时PHB的产量最高，为细胞干重的58.37±1.22％。在废水培养60h时，PHB的积累量达到最高，占细胞干重的42.54士0.93％，且水质变得清澈。
　　(3)菌株WG5通过葡萄糖合成途径合成PHB，PHB合成基因phbC位于2940001bp-2970000bp段AM586_13300、AM586_14055、AM58616290处，AM586_13300基因与Massilia UMI-21菌株的phaC基因最相似，相似度达82％。位于AM586_13305处的片段为PHB合成调控基因phbR,与Massilia UMI-21菌株的phbR基因最相似，相似度达87％。此外菌株还含有PHB的降解基因，位于补充序列2100001-2130000段的AM586_09250处，该基因的表达是PHB成为可被微生物利用的小分子物质的关键所在。
　　(4)菌株WG5合成的PHB聚合物样品纯度较高、均匀整齐、聚合度较好，其数均分子量(Mn)为124072，聚合度为1192，成型工艺温度约为208℃，起始热失重温度240℃，温度达到280℃时，材料急剧降解，生成CO2和H2O，引起失重，失重率达到96.86％。
　　(5)菌株WG5合成的PHB膜在三种类型土壤中的降解速度差异较大，在壤土中的降解速度最快，35d基本完全降解。黏土中PHB膜的降解启动相对较为缓慢，约在35d开始、降解，至75d基本完全降解，降解率达93.20％;PHB膜在砂土中的降解处于中间水平，培养35d约有50％被降解，培养至75d基本完全降解，降解率为95.90％。与PE地膜相比，PHB膜的降解时间大大缩短。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言

1．1 聚羟基丁酸酯(PHB)概述

1．2 PHB的结构及理化性质

1．3 PHB的检测方法

1．3．1 PHB的定性鉴定方法

1．3．2 PHB的定量分析方法

1．4 PHB的生物合成

1．4．1 PHB的生物合成途径

1．4．2 PHB代谢相关的酶

1．5 PHB在土壤中的降解

1．6 PHB的应用

1．7 本论文的研究内容、意义及技术路线

1．7．1 研究的内容

1．7．2 研究的意义

1．7．3 技术路线

2 Massilia sp．WG5合成PHB的定性鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料

2．1．2 主要试剂与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 透射电子显微镜(TEM)法观察

2．2．2 双光子激光共聚焦显微镜观察

2．2．3 气相色谱法

2．3 结果与讨论

2．3．1 透射电子显微镜(TEM)法观察结果

2．3．2 双光子激光共聚焦显微镜观察结果

2．3．3 气相色谱法测定结果

2．4 本章小结

3 Massilia sp．WG5合成PHB的条件优化及合成途径推断

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂与仪器

3．1．2 实验方法

3．2 结果与讨论

3．2．2 环境因素对WG5合成PHB的影响

3．2．3 Massilia sp．WG5合成PHB的途径推断

3．3 本章小结

4 PHB膜材料性能表征

4．1 材料与方法

4．1．1 供试材料

4．1．2 主要试剂与仪器

4．2 PHB膜性能表征方法

4．2．3 傅里叶红外衍射法(FTIR)分析

4．2．4 核磁共振法(NMR)分析材料结构

4．2．5 热重法(TGA)分析材料的热稳定性

4．2．6 示差扫描量热法(DSC)分析材料的热性质

4．3 结果分析

4．3．1 PHB材料的分子量

4．3．2 傅里叶红外衍射法(FTIR)结果分析

4．3．3 核磁共振法(NMR)结果分析

4．3．4 热重(TGA)结果分析

4．3．5 示差扫描量热法(DSC)结果分析

4．4 本章小结

5 PHB膜在土壤中的降解

5．1 材料与方法

5．1．1 供试土壤

5．1．2 供试材料

5．1．3 主要试剂与仪器

5．2 实验方法

5．2．1 PHB膜的制备与纯化

5．2．2 土壤降解实验设计

5．3 结果与讨论

5．3．1 PHB膜在不同类型土壤中的降解

5．3．2 PHB膜在不同类型土壤中的形貌变化

5．4 小结

6 结论与展望

6．1 研究结论

6．2 研究展望

参考文献