紫外诱导圆锥铁线莲次生代谢扰动的调控机制研究及香豆素合成酶PPO的克隆与表达

摘要

中药和天然药物有效成分含量偏低是限制中医药发展的关键因素。近年来，通过改良道地药材品质、改善药材种植环境等优化措施，中药材品质逐年提升。我们研究组运用紫外诱导技术，能显著提高药用植物中有效成分的含量，为提高药材品质提供了新的方法。植物响应紫外诱导的方式，主要体现为吸收紫外光次生代谢物的形成和积累。这些次生代谢产物多数为中药有效成分，包括黄酮、香豆素、蒽醌、萜类、生物碱等。
　　圆锥铁线莲是浙北地区抗肿瘤和治疗慢性前列腺炎的常用中药，疗效肯定，但有效成分含量偏低，严重影响了圆锥铁线莲的推广和开发应用。前期我们对圆锥铁线莲响应紫外诱导以及暗培养(HUVB+D)代谢扰动进行了深入研究，发现在双重胁迫下圆锥铁线莲的生理状态及一系列次生代谢产物发生了显著变化和积累。有效成分含量显著增加，分析证明香豆素类化合物是扰动的次生代谢物中主要成分，主要包括10-demethyl-luvangeti、4，6，7-trimethoxy-5-methyl-2H-chromen-2-one和luvangetin。研究组进一步通过相关实验证明了多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是香豆素基本结构七叶亭生物合成的关键酶，主要催化咖啡酸侧链的内酯化而形成七叶亭。本文在上述研究基础上进一步对圆锥铁线莲HUVB+D下次生代谢物扰动的调控机制进行了研究，并对香豆素生物合成途径的关键酶PPO进行了克隆和表达分析。本课题的主要研究内容和结果如下:
　　(1)紫外诱导圆锥铁线莲次生代谢扰动的调控机制研究
　　本文主要以代谢组学技术，并结合qRT-PCR、激素含量测定、生理指标以及酶活检测等技术手段，对HUVB+D胁迫下圆锥铁线莲中次生代谢扰动的调控机制进行研究。qRT-PCR显示在HUVB+D下UVR8(UV resistance locus8)初始信号通路被激活。激素水平以及其生物合成途径中关键基因的表达量和中间产物含量测定显示茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)信号通路亦被激活。基于GC-MS的代谢组学分析显示，HUVB+D胁迫处理后氨基酸代谢、碳水化合物代谢、有机酸代谢以及脂质代谢均有所增强。通过对照组(CG)、JA富集组(JG)、JA抑制组(IG)中差异变化代谢物聚类以及KEGG代谢通路分析，显示HUVB+D胁迫后JG中咖啡酸和二氢香豆素类次生代谢物的含量大于CG和IG，而JG中脯氨酸的含量小于CG和IG;谷氨酸脱氢酶酶活检测结果显示JA可以增加氮源到碳源的转化率。上述结果表明，圆锥铁线莲在HUVB+D下UVR8初始信号通路被激活，并进一步激活了JA和SA信号通路;JA和SA通过调节碳氮转化分别增加次生代谢物和脯氨酸的含量来降低HUVB+D胁迫下活性氧的水平，从而起到协调保护作用，增强了植物的胁迫耐受性。
　　(2)圆锥铁线莲多酚氧化酶的克隆和表达
　　通过分析圆锥铁线莲中多酚氧化酶转录组数据和RACE得到的序列片段，结合本研究中genome walking技术，得到了总长度为1975bp的多酚氧化酶的碱基序列，其中包含长度为590个氨基酸的完整ORF区。对该序列所编码的蛋白进行理化性质预测以及系统进化树分析，预测圆锥铁线莲PPO分子量为66.32kD、是位于叶绿体中不稳定的亲水性蛋白，且与荷花PPO亲缘关系最近。通过构建pET-28a(+)-CtPPO重组蛋白并在大肠杆菌BL21中经IPTG法诱导表达得到目的蛋白。SDS-PAGE检测分析确认在28℃、180rpm、0.8mM的IPTG诱导表达6h条件下目的蛋白的表达量最高，并且在上清和沉淀中均有表达，且较多部分以包涵体形式存在。通过诱导条件优化，发现在16℃、180rpm、0.8mM的IPTG诱导可溶性蛋白表达量比例显著增高。对表达的重组蛋白上清进行Ni柱纯化，获得了较高纯度的CtPPO蛋白。
　　通过以上研究基本阐明了圆锥铁线莲响应HUVB+D胁迫次生代谢扰动的信号转导和调控机制;并对香豆素七叶亭合成的关键酶PPO进行了克隆和原核表达。该研究丰富了植物次生代谢产物响应逆境作用机制的内容，为药用植物有效成分生物合成提供了新的思路，促进了中药资源的合理运用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

第1章 绪论

1．1 植物对胁迫响应的研究进展

1．1．1 胁迫及其对植物的影响

1．1．2 UVB胁迫对植物的影响

1．1．3 植物响应胁迫的调控机制

1．1．4 植物响应UVB胁迫调控机制的研究进展

1．2 多酚氧化酶(PPO)研究进展

1．2．1 PPO简介

1．2．2 植物PPO研究现状

1．3 本文研究目的、内容与意义

1．3．1 紫外诱导圆锥铁线莲次生代谢扰动的机制研究

1．3．2 香豆素生物合成途径关键酶PPO的克隆和表达

第2章 紫外诱导圆锥铁线莲次生代谢扰动的调控机制研究

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 植物来源

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器

2．3 方法

2．3．1 样品处理

2．3．2 激素提取以及高效液相色谱-质谱鉴定

2．3．3 基因表达分析

2．3．4 代谢物提取以及气相色谱-质谱分析

2．3．5 差异交化代谢物(DCMs)的聚类分析

2．3．6 谷氨酸脱氢酶(GDH)酶活测定

2．3．7 生理指标测定

2．3．8 数据分析

2．4 结果

2．4．1 I-IUVB+D激活了圆锥铁线莲UVR8信号通路

2．4．2 HUVB+D激活了圆锥铁线莲JA／SA信号通路

2．4．3 代谢组分析揭示了HUVB+D下圆锥铁线莲代谢扰动机制

2．4．4 HUVB+D下CG、JG和IG组中差异代谢物聚类分析

2．4．5 HUVB+D下圆锥铁线莲JA和SA信号通路相互作用机制

2．4．6 HUVB+D下圆锥铁线莲JA和SA对次生代谢的影响

2．4．7 谷氨酸脱氢酶分析

2．4．8 CG、JG、IG和SG中圆锥铁线莲氧化损伤程度检测

2．5 讨论

2．5．1 HUVB+D激活了UVR8和JA信号通路

2．5．2 SA通过调节氨基酸代谢来促进脯氨酸的积累

2．5．3 JA通过C／N转化促进圆锥铁线莲HUVB+D下次生代谢

2．5．4 JA和SA相互作用最大限度增强了圆锥铁线莲对HUVB+D的防御能力

2．6 小结

第3章 香豆素生物合成途径关键酶PPO的克隆和原核表达

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 样品

3．2．2 质粒与菌株

3．2．3 主要试剂

3．2．4 主要仪器

3．3 方法

3．3．1 溶液及培养基

3．3．2 目的序列的获取

3．3．3 CtPPO基因生物信息学分析

3．3．4 CtPPO原核表达载体的构建

3．3．5 CtPPO在大肠杆菌中的诱导表达

3．3．6 CtPPO重组蛋白的分离纯化

3．4 结果

3．4．1 目的序列

3．4．2 CtPPO生物信息学分析

3．4．3 CtPPO在大肠杆菌中的表达

3．4．4 重组蛋白的分离纯化

3．5 讨论

3．5．1 CtPPO的诱导表达

3．5．2 CtPPO的激活特异性响应HUVB+D胁迫

3．5．3 CtPPO的激活可能受激素调控

3．6 小结

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

个人简介