抗菌肽KR-22的抗菌特性及其对巨噬细胞炎症反应的影响

摘要

抗菌肽是机体先天免疫的重要效应分子，因其抗菌谱广、杀菌机制独特、不易产生耐药性等特点被广泛研究。本课题组前期通过分子改良技术获得了具有高稳定性的新型抗菌肽KR-22，然而其生物学活性大小还不清楚。本研究对抗菌肽KR-22的体外抗菌活性及其安全性进行评估，并开展了抗菌肽KR-22对断奶仔猪腹泻的治疗效果研究;在此基础上，以细菌感染巨噬细胞为模型，探究抗菌肽KR-22对巨噬细胞炎症反应的影响及其可能机制。主要研究结果如下:
　　试验一 抗菌肽KR-22的体外抗菌活性及安全性研究
　　本试验研究了抗菌肽KR-22对常见致病菌和益生菌的体外抗菌活性及其对真核细胞的细胞毒性。抗菌活性检测结果显示，抗菌肽KR-22具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌大肠杆菌K88、大肠杆菌K12、大肠杆菌O157以及鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC25923均有较强的抗菌活性，而对肠道益生菌双歧杆菌的抑制作用较小。杀菌速率结果显示，抗菌肽KR-22能在20min内快速地杀灭大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013，总体速率高于青霉素;提示抗菌肽KR-22能快速高效地发挥杀菌作用。初步研究杀菌机制，抗菌肽KR-22作用后细菌细胞膜表面出现了不同程度的凸起或破损，胞内物质渗出;提示抗菌肽KR-22能快速作用于细胞膜，诱导细菌死亡。细胞毒性结果显示，在浓度小于128μg/mL下，抗菌肽KR-22对猪红细胞的溶血率较低，且对猪外周血单个核细胞(PBMCs)增殖无明显抑制作用;提示抗菌肽KR-22对真核细胞的细胞毒性较低。综上提示，抗菌肽KR-22具有高抗菌活性、低细胞毒性，是一种高效安全的新型抗菌肽。
　　试验二 抗菌肽KR-22对断奶仔猪腹泻的治疗效果研究
　　试验选择21日龄杜长大断奶腹泻仔猪18头，分别腹腔注射3次生理盐水（对照组）、抗菌肽CWA(抗菌肽CWA组)及抗菌肽KR-22（抗菌肽KR-22组），探究抗菌肽KR-22对断奶仔猪腹泻的治疗效果及其对仔猪炎症反应的影响。结果表明，与对照组相比，抗菌肽KR-22显著降低了断奶仔猪腹泻率和腹泻指数(P＜0.05)。在血清免疫因子方面，与对照组相比，抗菌肽KR-22降低了促炎因子TNF-α及IL-6的含量(P＜0.05)，提高了转化生长因子TGF-β的含量(P＜0.05);同时，抗菌肽KR-22降低了血清中免疫球蛋白IgM、IgG的含量(P＜0.05)。在血液免疫细胞方面，与对照组相比，抗菌肽KR-22降低了血液的中性粒细胞数量(P＜0.05)，提示抗菌肽KR-22能够有效地缓解细菌性感染引起的炎症反应。综上提示，抗菌肽KR-22可能通过下调炎症因子IL-6、TNF-α的表达，降低中性粒细胞含量以缓解断奶仔猪细菌性感染，进而缓解断奶仔猪腹泻。
　　试验三 抗菌肽KR-22调节巨噬细胞炎症反应的机制研究
　　在发现抗菌肽KR-22有效缓解断奶仔猪腹泻及仔猪炎症反应的基础上，以细菌感染巨噬细胞为模型，探究抗菌肽KR-22对巨噬细胞炎症反应的调控机制。建立大肠杆菌K88（E.coli K88）感染巨噬细胞模型，结果表明，E.coli K88能够诱导巨噬细胞炎症反应，且呈时间依赖效应。在炎症反应方面，与E.coli K88感染巨噬细胞相比，抗菌肽KR-22显著抑制了E.coli K88激活的巨噬细胞TLR-4/NF-κB信号蛋白的表达（P＜0.01），降低了E.coli K88感染巨噬细胞中促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达(P＜0.01)，细胞内活性氧ROS的含量明显下降。提示抗菌肽KR-22通过抑制NF-κB炎症信号通路及下游炎症因子的表达来缓解E.coli K88感染巨噬细胞的炎症反应。在调控巨噬细胞极化方面，与E.coli K88感染巨噬细胞相比，抗菌肽KR-22显著抑制了E.coli K88激活的M1型巨噬细胞关键蛋白STAT1及相关基因CCL3、iNOS及COX-2的表达（P＜0.05），而抗菌肽KR-22显著提高了M2型巨噬细胞关键蛋白STAT6及相关基因IL-10、TGF-β及Arg-1的表达(P＜0.05)。免疫荧光鉴定巨噬细胞表型，与E.coli K88感染巨噬细胞相比，抗菌肽KR-22明显降低了M1型标记蛋白CD86的表达，提高了M2型标记蛋白CD206的表达;进一步提示抗菌肽KR-22调节E.coli K88诱导的M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。综上提示，抗菌肽KR-22可能通过下调M1型信号通路STAT1/NF-κB，上调M2型信号通路STAT6从而缓解E.coliK88诱导的巨噬细胞炎症反应。
　　上述研究不仅为高效安全的新型抗菌肽鉴定提供了基础数据，而且为抗菌肽的免疫调控作用提供新的研究思路，为抗生素替代品的研发提供理论参考。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

图表目录

缩略词表

1 抗菌肽的研究进展

1．1 抗菌肽的分类

1．2 抗菌肽的生物学活性

1．3 抗菌肽的作用机制研究

1．4 提高抗菌肽活性的优化策略研究

1．5 抗菌肽的免疫调节作用及其机制

1．6 抗菌肽的应用前景

2 巨噬细胞的研究进展

2．1 巨噬细胞的极化类型

2．2 巨噬细胞极化的信号通路

2．3 病原感染对巨噬细胞的影响

2．4 调节巨噬细胞极化的作用

2．5 抗菌肽对巨噬细胞炎症的调控作用

3 本研究的目的意义和主要内容

3．1 目的意义

3．2 主要内容

第二章 抗菌肽KR-22的体外抗菌活性及安全性研究

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 试验结果

2．2 抗菌肽KR-22的最小抑菌／杀菌浓度(MIC／MBC)

2．3 抗菌肽KR-22对细菌的杀菌速率

2．4 抗菌肽KR-22对细菌细胞膜的破坏作用

2．5 抗菌肽KR-22对真核细胞的细胞毒性研究

3 讨论

第三章 抗菌肽KR-22对断奶仔猪腹泻的治疗效果研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 试验结果

2．2 KR-22对断奶仔猪血清细胞因子的影响

2．3 KR-22对断奶仔猪血清免疫球蛋白的影响

2．4 KR-22对断奶仔猪血液免疫细胞的影响

3 讨论

第四章 抗菌肽KR-22调节巨噬细胞炎症反应的机制研究

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 试验结果

2．1 E．coli K88感染对巨噬细胞炎症的影响

2．2 KR-22对E．coli K88诱导的巨噬细胞炎症反应的调节作用

2．3 KR-22调控巨噬细胞炎症的机制研究

2．4 KR-22调控巨噬细胞M1／M2表型的鉴定

2．5 不同表型巨噬细胞吞噬功能的鉴定

3 讨论

1 结论

2 创新点

3 研究展望

参考文献

作者简历与主要发表论文情况