基于核酸扩增技术的柑橘黄龙病检测方法研究

摘要

柑橘黄龙病（Citrus huanglongbing，HLB）是世界范围内最具毁灭性的柑橘病害之一，给柑橘产业造成巨大经济损失，实现其现场快速检测具有重要意义。本课题以HLB最主要的病原菌Las（Candidatus Liberibacter asiaticus）为研究对象，着眼于其在现场检测中存在的问题，以核酸扩增技术为基础，对核酸提取、核酸扩增、扩增产物检测这三个模块的快速化、简洁化地完成进行研究，探索新型、简便、快速的Las现场检测方法。
　　本论文的主要研究内容及结论如下:
　　(1)建立了Las实时荧光PCR(Polymerase Chain Reaction)检测方法。设计3组Las PCR引物并筛选出扩增效果最优的引物对，通过退火温度的调节解决PCR的非特异性扩增问题，最后评估了该体系的检测灵敏度，其灵敏度与目前较常用的OI1/OI2c PCR方法相当。综上，所建立的Las实时荧光PCR检测方法可代替OI1/OI2e PCR，用于Las的日常检测。
　　(2)建立了基于环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)的Las现场可视化检测方法。设计LAMP引物并优化LAMP体系，使得LAMP在35 min内完成。探究出氢氧化钠(Sodium hydroxide，NaOH)粗提取柑橘叶片核酸的最优条件为3 min裂解和50倍稀释。随后开发了一种新型的基于低浓度荧光染料的LAMP扩增产物可视化检测法，并设计了一个迷你荧光检测装置与之相配套。实验发现，可视化检测时的背景信号来源为易形成二级结构的高浓度高长度LAMP引物，但可以通过加热去除。所建立的基于LAMP的Las现场可视化检测方法的灵敏度比TaqMan PCR高100倍，其可行性也通过实际样本的检测得到验证。综上，所建立的基于LAMP的Las现场可视化检测方法简单、快速、灵敏、可视化信号明显、无需复杂仪器设备，适用于Las的现场检测。
　　(3)建立了基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的Las现场快速可视化检测方法。设计了3组Las RPA引物并筛选出最优引物对，优化扩增温度为37℃。探究出NaOH核酸粗提法用于RPA检测Las的最佳处理时间为1 min。随后实验发现，SYBR GreenⅠ可视化检测RPA扩增产物时，采用0.36μM引物的RPA体系扩增10 min后加入1μL SYBR GreenⅠ并稀释2倍时，消除背景信号的效果最优。同时，引入一个一次性密闭卡盒，避免可视化检测时开盖操作引起气溶胶污染。所建立的基于RPA的Las现场快速可视化检测方法灵敏度和OI1/OI2c PCR方法相当，可行性也通过实际样本的检测得到验证。综上，所建立的基于RPA的Las现场快速可视化检测方法与之前报道的试纸条方法相比，更为简便、快速、经济，无需复杂昂贵仪器，检测过程只需15 min，是资源匮乏地区和现场检测Las的较优方案。

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致谢

摘要

插图清单

列表清单

符号清单

1．1 柑橘黄龙病概况

1．1．1 柑橘黄龙病的发生情况及分布

1．1．2 柑橘黄龙病症状和危害

1．1．3 柑橘黄龙病检测技术

1．2 基于核酸扩增技术的检测方法基本流程及其存在的问题

1．2．1 核酸提取

1．2．2 核酸扩增

1．2．3 扩增产物检测

1．2．4 本节小结

1．3 核酸扩增技术原理及在柑橘黄龙病检测中的应用

1．3．1 聚合酶链式反应(PCR)原理及其在柑橘黄龙病检测中的应用

1．3．2 环介导恒温扩增(LAMP)原理及其在柑橘黄龙病检测中的应用

1．3．3 重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)原理及其在柑橘黄龙病检测中的应用

1．3．4 本节小结

1．4 研究目的、内容和技术路线

1．4．1 研究目的和内容

1．4．2 技术路线

1．5 本章小结

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 材料和试剂

2．2．2 仪器设备

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 实时荧光PCR引物设计与体系建立

2．3．2 灵敏度评估

2．4 本章小结

3 基于LAMP的Las现场可视化检测方法的建立

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 材料和试剂

3．2．2 仪器设备

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 LAMP引物设计和体系建立

3．3．2 柑橘叶片核酸快速提取

3．3．3 LAMP产物可视化检测

3．3．4 基于LAMP的Las现场可视化检测方法灵敏度评估

3．3．5 实际样本检测

3．4 本章小结

4 基于RPA的Las现场快速可视化检测方法的建立

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 材料和试剂

4．2．2 仪器设备

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 RPA引物设计和反应体系建立

4．3．2 NaOH法快速提取柑橘叶片DNA

4．3．3 RPA扩增产物可视化检测

4．3．4 基于RPA的Las现场快速可视化检测方法灵敏度评估

4．3．5 实际样本检测

4．4 本章小结

5．1 主要研究结论

5．2 主要特色及创新点

5．3 进一步研究展望

参考文献

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