线虫神经胶质细胞和ADF神经元对感觉的调节及其机制研究

摘要

神经元和胶质细胞(glial cells)共同组成了我们的大脑。其中胶质细胞占了绝大多数，但对于胶质细胞的研究和认识却远落后于神经元。 在哺乳动物中枢神经系统中，胶质细胞主要分为三种：星形胶质细胞(astrocyte)、少突胶质细胞(oligodendrocyte)以及小胶质细胞(microglia)，而星形胶质细胞又占据了其中的大多数。星形胶质细胞起先被认为是不可兴奋的细胞，不能传导神经冲动，它们仅是为神经元提供必须的生存环境，能够调节细胞外神经递质浓度，起着支撑和保护神经元的作用。随着研究的深入，越来越多的证据表明胶质细胞非常活跃地参与了许多神经信号的传递过程。首先，从形态上来看，星形胶质细胞能包裹住突触形成“三重突触”结构，这提示星形胶质细胞可能对于神经冲动在突触间的传递有调节作用;随后，胶质细胞被证明表现有明显的钙升高，同时伴随有胶质递质(gliotransmitter)的释放。最后，这些递质能作用于突触前或者突触后，调节突触后膜受体的表达和活性，反馈调节神经元之间的信号传递。然而，对于胶质细胞的钙信号来源，目前还不甚清楚。普遍的观点认为，胶质细胞的兴奋依赖于神经元的兴奋，但研究结果多来源于离体培养的细胞或者是分离的脑片，在体研究还比较缺乏。这里，借助线虫作为在体模型，探讨线虫OLQ槽状胶质细胞(OLQ socket glia，OLsoc)以及Amphid鞘状胶质细胞（Amphid sheath glia，AMsh）对于外界刺激的钙响应以及其生理功能。 发现，用玻璃电极给予线虫鼻尖适当的机械刺激能够引起OLsoc强烈的钙升高。机械刺激引起的OLsoc钙升高沿突起(process)传播的速度较慢但能够持续较长的时间（有些能达到20分钟以上）。而被OLsoc包裹的OLQ神经元的钙升高则表现为快速上升且在短时间内(10s)就能回复至静息水平。长时程的钙升高提示OLsoc可能参与了对感觉的调制，如神经系统的适应性(adaptation)及可塑性(plasticity)。 为了进一步了解OLsoc钙信号的来源，对OLsoc进行离体单细胞培养，在确认细胞间没有任何突触连接的情况下分析OLsoc对于外界机械刺激的响应。分别对离体的OLsoc作了电生理和钙成像记录，发现机械刺激能引起离体的OLsoc很大的内向电流以及明显的钙信号，表明OLsoc能内源性地响应外界刺激。同时，还以OLsoc胶质细胞和被其包裹的OLQ神经元为例，初步研究了神经元和对应胶质细胞之间的信号传递。发现OLQ神经元的活性对OLsoc的机械响应并没有施以影响。这些结果说明OLsoc本身就可以响应外界刺激且该反应不受神经元的影响。 这里同时还记录了离体的AMsh对气味刺激的响应。现有的研究结果表明在体的AMsh可以被一系列的厌恶性刺激所激活，但还没有极为确切的证据表明这也是其自身感受的，所以想通过单细胞钙成像来验证其是否也能响应厌恶性气味刺激。钙成像结果显示单细胞AMsh也有着很好的嗅觉感受。OLsoc和AMsh都能直接感受外界刺激这一结果表明线虫胶质细胞的直接感受是其普遍存在的机制。 既然OLQ神经元和OLsoc都能自身感受外界的机械刺激，那么它们本身应该表达有能被机械刺激活化的机械敏感通道，但目前对于它们所表达的机械敏感通道研究多为钙成像结果，缺乏直接的电生理数据。这里，通过电生理记录筛选到DEG-1（DEG/ENaC离子通道家族）是OLQ细胞上的机械敏感通道。在研究OLsoc表达的通道时，发现，阻断目前在线虫研究中已知的一些通道对于OLsoc的钙升高没有显著影响，表明在OLsoc细胞上应该表达有一个未知、全新的机械敏感通道。 接下来继续研究OLsoc响应机械刺激后的钙升高是否有实时的功能性输出或对行为产生影响。首先，采用光遗传方法实时激活OLsoc，同时对其行为进行采集、分析。实验结果显示，OLsoc被激活没有引起线虫瞬时行为（后退）的改变。考虑到OLsoc的钙信号延迟时间较长，又增加了记录时间，但光照前后3分钟内的后退次数也没有显著差异。然后，试着采用组胺门控的氯离子通道(HisC11)来抑制OLsoc的活性。发现，OLsoc的活性被降低后能显著影响线虫响应鼻尖刺激(nose touch)的回避反应(reversal)或者是摆头反应(headwithdrawal)以及头部刺激引起的抑制觅食行为(suppression of foraging)行为。这些结果非常有力地证明了胶质细胞参与了线虫实时的行为输出。 考虑到reversal、head withdrawal和suppression of foraging行为与OLQ神经元相关，假设胶质细胞是通过影响了OLQ的功能进而使线虫的行为受损。为了验证这一假设，在OLsoc活性被减弱的情况下，对OLQ神经元响应机械刺激的钙响应进行了记录。发现，当OLsoc活性被抑制时，OLQ对于第一次机械刺激的响应正常，但对于5分钟后给与的第二次刺激的响应受到了抑制，即OLQ神经元对于反复刺激时的钙响应受到了抑制。前文里提到机械刺激引起的OLsoc钙升高表现出较长的时程，可能参与对感觉的调制。结合这里OLsoc失活对OLQ响应反复刺激的影响，认为线虫的OLsoc胶质细胞确实通过影响OLQ神经元的活性参与了实时行为输出。 综上所述，发现线虫的OLsoc胶质细胞能独立地响应外界的机械刺激，并且这种响应不受OLQ神经元的影响。同时还鉴定了OLQ上表达的机械敏感通道为DEG-1，但OLsoc上是一个还未知的机械敏感通道。行为学实验结果表明，OLsoc活性被抑制能使线虫nose touch引起的reversal、head withdrawal和头部刺激引起的suppression of foraging行为受到显著影响。进一步的机制研究表明，OLsoc通过降低OLQ神经元的机械刺激敏感性来实现对线虫行为的影响。我们的研究说明胶质细胞也能独立地感受到外界的刺激并帮助神经元进行信息的编码，为进一步揭示胶质细胞的具体功能提供了新的视角。 本文的第二部分探索了线虫ADF神经元对感觉的调节作用。 五羟色胺(5-HT)参与了线虫体内多种与生存、发育相关的行为，如产卵、进食、运动以及神经系统发育过程中神经元的迁移等。已有的研究表明线虫体内的五羟色胺能神经元有ADF、NSM、HSN等，其中ADF神经元是雌雄同体线虫体内唯一的五羟色胺能感觉神经元。文献报道指出ADF神经元能够探测到一些特定的化学刺激，如cAMP，Cl-，Na+。然而，关于ADF本身对外界环境刺激或者改变的反应性质目前还知之甚少，比如说，它们能否被化学或者机械刺激所激活，如果可以，它们能产生什么样的行为输出呢？ 通过联合使用在体钙成像、遗传学操作、行为学检测以及神经元活性操控等方法，发现ADF神经元能够被一系列的伤害性刺激所激活，如一些厌恶性气味刺激以及机械刺激。有趣的是，偏好性刺激都不能激活ADF。铜离子(50mM)和高浓度IAA(1/100)引起的ADF钙升高受到递质传递的影响。通过特异性地沉默或激活ADF神经元，发现它们能够显著地影响ASH介导的后退行为，包括后退持续时间以及从接受刺激到起始后退的时间。钙成像结果显示，如果用TRPV1预先激活了ADF，那么铜离子和高浓度IAA引起的ASH钙升高就会受到抑制。这些数据表明ADF也活跃地参与了对外界环境的感知并细微地调节着线虫的行为。