羟基化维生素D3的菌种筛选及离子液体双相催化的初步研究

摘要

羟基维生素D3可以维持体内钙、磷的动态平衡，调节体内免疫及调控细胞的增殖与分化，在医药、食品和饲料等行业有广泛应用。目前生产羟基维生素D3的方法主要有化学合成与生物催化两种。羟基维生素D3的化学合成法反应步骤多，分离纯化复杂，成本高，环境污染严重，难以适应市场需要。生物催化相比化学合成，具有反应条件温和、反应速率快、反应专一性强、污染物少、能耗低等优点。使用新型绿色溶剂离子液体构成双相体系作为介质生物催化生产羟基维生素D3具有更加优越的前景。
　　本文首先通过富集培养基富集并分离得到了两株具有利用维生素D3作为唯一碳源能力的菌株，经过形态学鉴定初步认定筛得菌株一株是芽孢杆菌(Bacillussp.)HDZJU1-11，一株是链霉菌（Streptomyces sp.）HDZJU1-12。进一步的摇瓶转化实验证明了这两株菌具有羟化维生素D3的能力。
　　随后，本研究使用离子液体构成双相体系，用筛选得到的芽孢杆菌HDZJU1-11作为生物催化剂催化维生素D3的羟基化反应。通过测定底物在不同离子液体中的溶解度和分配系数，以及分析芽孢杆菌对不同离子液体的生物相容性，选择了3种离子液体（[BMIm][PF6]、DMIm][NTf2]和[OMIm][NTf2]）分别与缓冲液构成双相体系。实验优化了转化反应的条件，在菌株菌龄为12h，两相体系相比4∶1，水相pH为7.5时转化效果最好;而随着底物浓度增大转化率和产率（以质量计算）会有所下降。在最优转化条件下，产物25-羟基维生素D3最高产量为0.38 mg/mL，产率达76.1％。
　　通过基因工程技术，将羟化维生素D3能力的链霉菌HDZJU1-12中的羟化酶P450001、P450002基因全部克隆到大肠杆菌中，对菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-p450001和E.coli BL21(DE3)/pET28a-p450002进行蛋白诱导表达之后，分别加入一定量维生素D3和7-脱氢胆固醇进行代谢转化，结果证明了P450001、P450002分别能羟化维生素D3、7-脱氢胆固醇为目的产物25-羟基维生素D3及25-羟基-7-脱氢胆固醇。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 维生素D3与羟基维生素D3概述

1．1．1 维生素D3与羟基维生素D3的结构与性质

1．1．2 羟基维生素D3的应用

1．2 羟基维生素D3的生产

1．2．1 羟基维生素D3的化学合成

1．2．2 羟基维生素D3的动物细胞生物催化

1．2．3 羟基维生素D3的微生物催化

1．2．4 基因工程技术在羟基维生素D3生物催化中的应用

1．2．5 羟基维生素D3的微生物催化的一些问题

1．3 离子液体与生物催化

1．3．1 离子液体的结构和性质

1．3．2 离子液体双相体系的特点

1．3．3 离子液体双相体系在生物催化中的应用

1．3．4 离子液体双相体系在生物催化应用中的问题

1．4 本文的研究设想与意义

1．5 本文的主要研究内容

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 培养基

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 溶解度和分配系数的测定

2．3．2 菌株的培养及摇瓶转化

2．3．3 生物相容性的测定

2．3．4 芽孢杆菌生长曲线的测定

2．4 分析方法

2．4．1 高效液相色谱测定底物与产物浓度

2．4．2 底物和产物标准曲线的绘制

2．4．3 分配系数的计算

2．4．4 生物相容性的计算

3 羟化维生素D3菌株的筛选

3．1 引言

3．2 实验试剂与方法

3．2．1 实验试剂

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 羟化维生素D3菌株的富集与分离

3．3．2 形态学鉴定

3．3．3 摇瓶转化

3．4 本章小结

4 离子液体双相体系生物催化维生素D3羟基化

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验菌株

4．2．2 实验试剂

4．2．3 菌株的培养及摇瓶转化

4．2．4 离子液体的回收

4．2．5 高效液相色谱测定产率和转化率

4．3 结果与讨论

4．3．1 芽孢杆菌的生长曲线

4．3．2 离子液体的选择

4．3．3 两相体系相比对转化的影响

4．3．4 水相pH对转化的影响

4．3．5 底物浓度对转化的影响

4．3．6 离子液体的回收

4．4 本章小结

5 维生素D3羟基化酶的重组表达及催化反应

5．1 引言

5．2 实验试剂

5．2．1 核酸电泳试剂

5．2．2 0．5 MIPTG

5．2．3 50mg／mL硫酸卡那霉素

5．3 实验方法

5．3．1 链霉菌基因组的制备

5．3．3 重组表达载体的构建

5．3．4 重组菌株的构建与验证

5．3．5 P450001与P450002重组菌的生物转化

5．4 结果与讨论

5．4．1 P450001与P450002目的基因的获取

5．4．2 重组载体的构建

5．4．3 重组子的筛选和鉴定

5．4．4 重组子的底物投料转化

5．5 本章小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

作者简历