土壤中手性除草剂2-甲-4-氯丙酸选择性降解与转化过程研究

摘要

手性苯氧羧酸类除草剂应用广泛，但其过量使用在带来污染的同时，也会威胁人类的健康。国内外学者对其选择性降解的研究十分广泛，但对其降解过程中碳同位素(13C/12C)分馏、相关功能基因丰度以及微生物群落变化的研究报道较少，对映体选择性降解与转化具体机制尚不明确。
　　本文以外消旋(Rac-)、R型和S型这三种形态的典型手性除草剂2-甲-4-氯丙酸(2-(4-chloro-2-methylphenoxy)propanoic acid，mecoprop，MCPP）为研究对象，探究它们在四种土壤中的降解动力学、选择性降解与转化、同位素分馏效应，以及对土壤中微生物相关功能基因丰度与群落结构的影响。主要研究结果如下:
　　(1)Rac-MCPP，R-MCPP和S-MCPP在土壤中的降解符合一级反应动力学模型，灭菌对照表明，MCPP在土壤中的降解与对映体分馏均由微生物引起。非灭菌条件下，Rac-MCPP的降解半衰期为3.12～6.93天，Rac-MCPP在不同土壤中表现出不同的降解选择性，玉米土（合肥）中表现为R型对映体优先降解，对映体分馏EF终值为0.36±0.01，桑园土（杭州）中先表现为R型优先降解后转变为S型优先降解，EF终值为0.57±0.02，茶园土（杭州）与菜地土（杭州）中均表现为S型对映体优先降解，EF终值分别为0.75±0.02、0.92±0.01。降解选择性ES与土壤pH显著正相关。
　　(2)单体培养结果表明，MCPP在土壤降解过程中存在对映体转化，且都偏向于R型→S型单体转化。桑园土（杭州）与茶园土（杭州）中平衡常数K(KRs/KsR)分别为2.23、2.19，且桑园土（杭州）中转化速率最高;玉米土（合肥）与菜地土（杭州）中仅有R型向S型单体转化;四种土壤中各对映体单体的实际降解速率大小关系与外消旋体降解情况一致，并且都大于后者，表明对映体转化现象会影响对映体选择性。
　　(3)Rac-MCPP在四种土壤降解过程中均有显著碳同位素富集，单体培养过程中除玉米土（合肥）与桑园土（杭州）S型单体培养外，其它土壤中均有显著碳同位素富集;计算得到的表观动力学效应常数AKIE在1.008～1.032之间，C-H键断裂的表观动力学效应常数AKIE=1.00～1.03，表明降解初始反应均为C-H键的断裂。
　　(4)qPCR与PCR结果显示，四种土壤添加Rac-MCPP，R-MCPP和S-MCPP培养下，均没有检测出rdpA基因，而sdpA基因均能测出，且相对丰度随培养过程发生变化。在S型单体培养下在桑园土（杭州）中达到相对丰度最大值7.3。外消旋培养下基因增长相对丰度低于单体培养结果，表明初始浓度对后续微生物降解影响较小，甚至可能浓度过高时会抑制含功能基因微生物活性。同时R型单体培养条件下，sdpA基因丰度会产生变化也表明存在对映体转化;
　　(5)16S rRNA Illumina高通量测序结果显示，添加MCPP后四种土壤中微生物群落的物种丰富度（Chao1值，shannon指数）、物种丰度分布（均匀度，simpson指数）、群落组成均会有所变化，但随时间推移而逐渐恢复初始状态，外消旋处理效果较单体处理影响更为长久;四种土壤中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度显著增加，目前已报道降解菌多属于此门类，可深入挖掘降解相关菌群信息;
　　(6)sdpA扩增子高通量测序结果显示，土壤类型是决定菌群的主要因素，而土壤内部对比分析可得，不同处理和时间，对基因组成（物种组成）影响明显，且相对来说，外消旋处理的效果更持久;物种注释结果显示，共计比对成功120个已知菌株，其中包括MCPP已知降解菌株Sphingobium herbicidovorans，数量占比5％，排名第三，并未发现其余已知降解菌。此外，测序所得物种大多还是未知的。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

1绪论

1．1前言

1．2手性除草剂2-甲-4-氯丙酸选择性降解研究进展

1．2．1苯氧羧酸类除草剂

1．2．2 MCPP的基本性质

1．2．3 MCPP在环境中的选择性行为

1．2．4 MCPP降解机制研究

1．3环境中有机污染物生物降解的研究方法

1．3．1对映体分析方法

1．3．2单体同位素分析方法

1．4本文的研究目的、意义和主要内容

1．4．1研究目的与意义

1．4．2研究主要内容

1．5研究技术路线

2农田土壤中MCPP的选择性降解与转化

2．1前言

2．2材料与方法

2．2．1仪器与试剂

2．2．2实验方法

2．3结果与讨论

2．3．1四种土壤基本理化性质

2．3．2土壤中外消旋体MCPP的降解

2．3．3外消旋体MCPP对映体分馏情况

2．3．4土壤中MCPP单体的降解与转化

2．4本章小结

3应用CSIA评价土壤中MCPP的生物降解

3．1前言

3．2材料与方法

3．2．1实验材料

3．2．2衍生化条件与方法

3．3结果与讨论

3．3．1 Rac-MCPP同位素分馏

3．3．2 R-MCPP同位素分馏

3．3．3 S-MCPP同位素分馏

3．3．4 MCPP生物降解的评估

3．4运用对映体分析和碳同位素分析方法评估MCPP的生物降解

3．4本章小结

4土壤中微生物群落与功能基因相对丰度变化

4．1引言

4．2材料与方法

4．2．1仪器与试剂

4．2．2实验方法

4．3结果与讨论

4．3．1功能基因rdpA与sdpA相对丰度变化

4．3．2 16S rRNA Illumina MiSeq高通量测序

4．3．3 sdpA扩增子Illumina MiSeq高通量测序结果

4．4本章小结

5研究结论与展望

5．1研究结论

5．2研究展望

5．3研究创新点

参考文献

攻读硕士期间获得成果