咪唑乙烟酸对土壤微生物群落的影响及其降解的手性差异研究

摘要

农药的大量使用已给环境造成了严重的危害。当今使用的农药中半数为外消旋的手性农药。不同对映体的手性农药有极大的生物有效性差异，因此许多学者建议在农业生产中选用生物有效性强的对映体以降低农药的用量。但首先需探明每一种对映体农药使用后对环境的影响及其降解特征，以避免盲目使用生物有效性强的对映体农药对环境造成严重危害。本研究以目前大量使用的除草剂咪唑乙烟酸(Imazethapyr，IM)为对象，研究其对土壤微生物群落结构的影响及其在土壤中降解的手性差异。主要研究内容为:IM对映体对土壤微生物群落结构的影响;生物因素对IM对映体降解的影响;环境因素对IM对映体降解的影响;IM对映体高效降解菌的探索等这四个方面，概述如下: 16S rRNA基因（V3-V4区）的Illumina高通量测序分析发现(-)-R-IM处理的大豆种植土壤中细菌群落结构与(+)-S-IM处理存在显著性差异，且差异随着处理浓度的上升而扩大。有趣的是，固氮菌科和包括短根瘤菌属、甲基杆菌属和类芽孢杆菌属等在内的其他有益菌在(-)-R-IM处理土壤中明显多于在(+)-S-IM土壤。然而，欧文氏菌属、假单胞菌属、伯克氏菌属、链霉菌属和农杆菌属等的有害菌属的情况刚好相反，(-)-R-IM对这些有害菌属有明显的抑制作用。进一步观察发现，(-)-R-IM处理的土壤恢复到初始细菌群落结构的速度显著快于(+)-R-IM处理土壤。该研究结果将为低持久性、高效率、生态友好的对映体(-)-R-IM的开发与应用提供理论支持。 研究环境因子pH、温度和湿度对于IM选择性降解的影响发现，在不同的pH、温度和湿度条件下，左旋咪唑乙烟酸单体(+)-S-IM的残留率始终高于右旋咪唑乙烟酸单体(-)-R-IM。在浙江省境内的四种受试土壤类型中，选择性降解差异EF值（S-对映体/（S-对映体+R-对映体），表征选择性降解差异）在15℃至35℃范围内随着温度上升而增加，在30-35℃之间达到最佳效果;咪唑乙烟酸对映体的残留率在土壤最大田间持水量50％至60％时为最小，且选择性降解效果最佳((-)-R-IM效果最好，EF最大）;(+)-S-IM偏向于在弱酸性降解条件，(-)-R-IM则偏向于弱碱性降解条件，且选择性降解的差异在弱碱性条件下达到最大。土壤有机质含量与对映体选择性降解差异(EF值，且EF＞EF0)成正相关。以上结果说明，可通过调节pH、温度和湿度等环境因素来调控IM对映体在土壤中的作用时长和剂量，为IM外消旋体和对映体在实际中的应用提供良好的理论指导。 通过生物因素对IM对映体在土壤中降解的影响研究结果表明，与灭菌土壤相比，土壤未灭菌处理显著降低IM对映体在土壤中的残留率，并扩大其EF值。添加蚯蚓能进一步降低IM对映体在土壤中的残留率，且(-)-R-IM比(+)-S-IM降低得更多。这表明土壤微生物在IM对映体的选择性降解中发挥重要作用，且在蚯蚓活动协同作用下进一步增强微生物的降解作用。进一步分析土壤微生物磷脂脂肪酸图谱(PLFAs)发现，60天的IM对映体处理对于微生物群落总量（以TotalPLFAs表征）和组成没有显著性影响，而蚯蚓的加入则能显著增加IM在降解过程中的微生物PLFAs总量、革氏阳性菌比例(G+)、细菌(Total Bact)比例和好氧细菌比例，并显著降低真菌(Total Fungi)比例以及微生物群落的环境营养压力。这从微生物群落结构和组成层面表明了微生物和蚯蚓在降解土壤IM的过程中的重要联合作用。 最后，研究者从受污染土壤中分离出了三种高效降解菌S1、S2和S3，它们分别属于Kocuria rosea、Microbacterium oxydans和Alcaligene faecalis。三种菌对(+)-S-IM和（-）-R-IM的最佳接种量均为7％，最佳初始底物浓度为100mg/L。三种菌的最佳降解温度在30-35℃之间，S2和S3的最佳降解温度相对于S1要高一些;S1菌株适合在偏酸性条件下降解IM，而偏碱性条件下S3菌株最适合;中性环境中S2菌株的降解能力最强。在最佳降解条件下，三种菌对（-）-R-IM的降解快于对(+)-S-IM的降解，EF值均始终大于初始值(EF0=0.5)，且菌株细胞数量与残留率呈负相关。外加碳源葡萄糖最大程度削弱S1对对映体的降解;柠檬酸钠最大程度削弱S2和S3对对映体的降解。在土壤介质中，受介质改变影响，IM对映体的降解速率下降（半衰期增大），残留率上升，手性降解差异缩小(EF趋向初始值)，并且下降的程度在未灭菌土壤中达到最大。说明外加碳源的竞争、环境介质的改变和其他微生物的干扰显著影响这三种高效降解菌对IM对映体的降解能力。

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摘要

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第1章文献综述

1．1 手性化合物和手性除草剂

1．1．1手性化合物与手性农药

1．1．2手性除草剂的种类与单一对映体的制备

1．1．3手性除草剂的分析检测技术

1．2 手性除草剂对映体选择性差异研究

1．2．1手性除草剂对映体生物有效性差异研究

1．2．2手性除草剂对映体环境归趋研究

1．3 手性除草剂-咪唑乙烟酸

1．3．1 咪唑乙烟酸除草剂的使用与环境问题

1．3．2 咪唑乙烟酸除草剂环境问题解决的探索

1．3．3咪唑乙烟酸对土嚷微生物及其群落影响研究

1．3．4咪唑乙烟酸环境问题解决的新希望—土襄微生物选择性降解

1．4 研究目的与意义

第2章问题的提出、技术路线和拟解决的问题

2．1 问题的提出

2．2 技术路线

2．3 拟解决的问题

第3章咪唑乙烟酸对映体影响土壤微生物群落的组成和结构

3．1 引言

3．2 试验材料与方法

3．2．1试验试剂

3．2．2试验仪器

3．2．3试验方法

3．3 试验结果

3．3．1 咪唑乙烟酸单体改变土壤细菌OTUs组成

3．3．2咪唑乙烟酸单体改变土壤细菌生物分类学的结构和组成

3．3．3 R-IM促进有益菌S-IM抑制病原菌

3．3．4土壤细菌群落在咪唑乙烟酸单体处理后出现不同程度的恢复现象

3．4 讨论

3．4．1 IM对映体对OTUs和分类水平上的影响

3．4．2 IM对映体对于功能菌的不同影响

3．4．3 IM对映体影响土壤微生物群落结构的恢复能力

第4章环境因子影响土壤中咪唑乙烟酸对映体的选择性降解

4．1 引言

4．2 试验材料与方法

4．2．1试验试剂

4．2．2试验仪器

4．2．3试验方法

4．3 试验结果

4．3．1 温度对土壤中眯唑乙烟酸手性降解的影响

4．3．2湿度对土壤中咪唑乙烟酸手性降解的影响

4．3．3 pH和有机质含量对土壤中咪唑乙烟酸手性降解的影响

4．4 讨论

4．4．1温度对土壤中咪唑乙烟酸手性降解的影响

4．4．2持水率对土壤中咪唑乙烟酸手性降解的影响

4．4．3 pH和有机质含量对土集中咪唑乙烟酸手性降解的影响

第5章生物因素影响土壤中咪唑乙烟酸对映体的选择性降解

5．1 引言

5．2 试验材料与方法

5．2．1试验试剂与材料

5．2．2试验仪器

5．2．3试验方法

5．3 试验结果

5．3．1土壤生物促进咪唑乙烟酸对映体选择性降解

5．3．2土壤动物蚯蚓和咪唑乙烟酸对映体影响土壤微生物群落组成和结构

5．4 讨论

5．4．1土壤蚯蚓促进土壤微生物对IM的降解并表现为手性降解差异

5．4．2蚯蚓和IM单体改变土壤微生物群落结构与组成

第6章咪唑乙烟酸对映体的高效降解菌研究

6．1 引言

6．2 试验材料与方法

6．2．1试验材料

6．2．2试验仪器

6．2．3菌株分离与纯化

6．2．4菌株形态及生理生化鉴定

6．2．5菌株16S rDNA序列测定

6．2．6高效降解茵对咪唑乙烟酸消旋体的降解性能测定

6．2．7高效降解茵对咪唑乙烟酸对映体的降解性能测定

6．2．8高效降解菌对土壤中咪唑乙烟酸消旋体的降解性能测定

6．3 试验结果

6．3．1 高效降解菌的鉴定和生理生化特性

6．3．2菌株接种量对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．3．3培养温度对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．3．4 pH值对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．3．5底物浓度对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．3．6外加碳源对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．3．7高效降解菌对咪唑乙烟酸单体降解的特异性降解

6．3．8 高效降解菌对土壤中咪唑乙烟酸消旋体的特异性降解

6．4 讨论

6．4．1菌株接种量与咪唑乙烟酸底物浓度对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．4．2培养温度对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．4．3 pH值对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．4．4底物浓度对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．4．5外加碳源对咪唑乙烟酸特异性降解的影响

6．4．6高效降解首对土壤中咪唑乙烟酸消旋体的特异性降解

第7章全文总结

7．1 主要研究结论

7．2 主要创新点

7．3 研究展望

参考文献

附录

作者在学期间所取得的科研成果