CAMTA3对植物抗核盘菌及水稻白叶枯病菌的调控功能及机制分析

摘要

由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病和稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae,Xoo)所致的白叶枯病分别是我国油料和蔬菜作物及水稻的重要病害。抗病调控分子机制的进一步解析有助于为这些病害的防控提出新的策略、提供更好的理论指导。钙信号途径是植物生长发育和胁迫响应的重要调控途径。CAMTA(Calmodulin-binding transcription activator)家族转录因子是结合Ca2+受体CaM的Ca2+信号途径重要因子。其中CAMTA3对植物基础抗性(Basal resistance)的重要调控作用及机制已经明确，但其对其他类型的抗病性如诱导抗性(Inducedresistance)和非寄主抗性(Nonhost resistance)的调控作用及分子机制尚不明确。另外，钙肥作为植物钙补充剂已经在生产上得到广泛应用。然而，钙肥对植物抗病性的诱导作用研究很少，其调控分子机制还不明确。本论文以核盘菌和Xoo为病原物对象，以对核盘菌的基础抗性、诱导抗性以及对Xoo的非寄主抗性为抗性对象，研究钙肥外源施用和CAMTA3对抗病性的调控作用及分子机制。获得的主要结果如下: (1)阐明了CAMTA3在拟南芥对核盘菌的基础抗性和Pep1激发的诱导抗性以及对Xoo的非寄主抗性中的广谱调控作用，揭示了基于CAMTA3-CBP60g/SARD1模块的水杨酸(Salicylic acid，SA)合成调控新途径及其在上述抗性中的重要作用。拟南芥cbp60g-1和sard1-1单、双突变体以及sid1、sid2/ics1和npr1-1等功能丧失型(Loss-of-function)突变体接种分析结果表明，CBP60g/SARD1-ICS1介导的SA合成和信号传导途径对上述三类抗性起正调控作用。拟南芥功能丧失型突变体camta3及功能获得型突变体(Gain-of-functionmutant)camta3-3D接种分析结果表明，CAMTA3对上述三类抗性起负调控作用。拟南芥camta3及camta3-3D突变体中CBP60g和SARD1基因表达分别显著上调和下调;凝胶阻滞分析显示CAMTA3 CG-1结构域和CBP60g基因、但不和SARD1基因启动子中CGCG box强烈、特异地结合;启动子活性LUC报告分析表明CAMTA3在植物体内负调控CBP60g和SARD1基因表达，而Pep1和Xoo减弱CAMTA3的这种负调控作用。说明CAMTA3直接负调控CBP60g、可能间接负调控SARD1，而Pep1和Xoo抑制CAMTA3该调控功能。这些结果表明，CAMTA3通过直接负调控CBP60g、可能间接负调控SARD1，抑制ICS1介导的SA合成，从而负调控抗病性;而Pep1和Xoo通过抑制CAMTA3该功能从而诱导抗病性。 (2)明确了钙肥外施对核盘菌抗性的诱导作用及调控分子机制。钙肥(有效成分为CaCl2，0.3 mg/ml)叶面喷雾显著诱导拟南芥和油菜产生对核盘菌的抗性，抗性持续期在5天以上。同样钙肥处理不能诱导cbp60g-1和sard1-1突变体产生这种抗性。LUC报告分析显示，钙肥抑制了CAMTA3对CBP60g和SARD1的负调控作用，但不显著改变CAMTA3基因表达，表明钙肥通过抑制CAMTA3蛋白对CBP60g和SARD1的负调控作用，释放CBP60g和SARD1，从而激发抗病性。 (3)鉴定获得了茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和RNA干扰(RNA intefering，RNAi)通路基因中的CAMTA3靶标基因，揭示CAMTA3参与调控这些通路。启动子序列结果显示，JA途径基因JAZ1、JAZ2、JAZ5、JAZ7、JAZ8和MYC2、ROS通路NADPH氧化酶基因RbohF以及RNAi通路基因AGO4、AGO5、AGO6、RDR1、RDR3、RDR4的启动子含有CGCG box。EMSA分析表明拟南芥CAMTA3 CG-1结构域在体外直接结合AGO4、AGO5、AGO6、RDR3、RBOHF、JAZ1和MYC2的启动子区CGCG box。启动子活性LUC报告分析发现在植物体内拟南芥CAMTA3正调控AGO5和JAZ1的转录表达。 综上所述，本研究阐明了拟南芥CAMTA3对核盘菌的基础抗性和诱导抗性以及对Xoo的非寄主抗性的广谱调控功能，揭示了基于CAMTA3以CBP60g和SARD1为靶标的SA合成调控新途径，明确了以该途径为基础的广谱抗病调控新机制。鉴定了JA、ROS和RNAi通路中的CAMTA3靶标，揭示了CAMTA3对这些通路的调控作用。明确了钙肥对核盘菌抗性的诱导作用，揭示了钙肥通过抑制CAMTA3对CBP60g和SARD1的负调控作用激发抗病性的分子机制。这些作用和机制的揭示增进了植物抗病分子机制的理解。Pep1和钙肥诱抗作用的发现，还为菌核病防控提供潜在的新方法。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章文献综述与研究背景

1．1．1植物钙信号途径及钙诱导植物抗病性的研究进展

1．1．2植物钙调蛋白结合性转录活化因子(CAMTAs)

1．1．3植物CAMTA3的结构特征

1．1．4植物CAMTA3靶标基因鉴定现状

1．1．5植物CAMTA3在抗生物和非生物胁迫中的作用

1．2水杨酸和茉莉酸途径在植物抗病性中的作用

1．3植物对核盘菌的抗性研究进展

1．3．1核盘菌的生物学特性及危害

1．3．2植物抗核盘菌研究进展

1．4植物对水稻白叶枯病菌非寄主抗性研究进展

1．5本研究的意义、内容及技术路线

第二章AtCAMTA3通过直接靶标CBP60g负调控植物对核盘菌和Xoo的抗性

2．1材料与方法

2．1．1植物材料及种植

2．1．4病原菌的培养及接种

2．1．6 RNA提取及反转录

2．1．7实时荧光定量PCR分析

2．1．8核盘菌菌量分析和病斑直径测量

2．1．9叶片内Xoo菌量计数

2．1．10拟南芥CAMTA3蛋白CG1结构域原核表达及纯化

2．1．11凝胶阻滞分析(EMSA)

2．1．12启动子活性的LUC报告分析

2．2结果与分析

第一部分：AtCAMTA3对多种抗病性的广泛调控作用

第二部分：AtCAMTA3调控三种抗性的机制

第三部分：基于调控CAMTA3功能的Xoo和Atpep1诱抗机制及核盘菌抑抗机制

2．3讨论

2．3．1 CAMTA3的广谱抗病调控作用

2．3．2 CAMTA3调控SA合成的分子机制

2．3．3 SA途径在植物抗核盘菌及对Xoo非寄主抗性中的作用

2．3．4 CAMTA3调控SA合成及抗病性的分子机制模式

第三章钙肥通过抑制CAMTA3提高植物对核盘菌的抗性

3．1材料与方法

3．1．1植物材料及种植

3．1．2供试菌株及载体

3．1．3供试试剂及培养基

3．1．4供试钙肥及施用方法

3．1．5 RNA提取及反转录

3．1．6实时荧光定量PCR分析

3．1．7核盘菌菌量分析

3．1．8启动子活性的LUC报告分析

3．2结果与分析

3．2．1钙肥喷施诱导拟南芥对核盘菌的抗性

3．2．2钙肥喷施诱导油菜对核盘菌的抗性

3．2．3拟南芥CBP60g和SARD1正调控钙肥诱导的对核盘菌的抗性

3．2．4启动子活性的LUC报告分析揭示钙肥抑制AtCAMTA3对CBP60g和SARD1基因表达的负调控作用

3．2．5钙肥处理没有显著影响CAMTA3基因表达

3．3讨论

第四章AtCAMTA3的抗病调控相关靶标基因的鉴定

4．1材料与方法

4．1．1植物材料及种植

4．1．2供试载体

4．1．3供试试剂及培养基

4．1．4 RNA提取及反转录

4．1．5凝胶阻滞分析(EMSA)

4．1．6启动子活性的LUC报告分析

4．2结果与分析

4．2．1 AtCAMTA3的潜在靶标筛选

4．2．2体外凝胶阻滞分析(EMSA)证明AtCAMTA3与JA、ROS和RNAi通路关键基因的直接互作

4．2．3启动子活性的LUC报告分析验证AtCAMTA3对JA、ROS和RNAi通路基因的体内直接调控作用

4．3讨论

5．1全文小结

5．2本研究创新之处

5．3后续研究

参考文献

附录