p38MAPK/GSK3信号通路及VGF参与Aβ1-42诱导的小鼠认知障碍及抑郁行为的调节

摘要

目的：1.研究p38丝裂原激活蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinases, p38MAPK）抑制剂 SB203580对可溶性β-淀粉样蛋白1-42寡聚体（soluble beta amyloid protein1-42 oligomers,SOAβ1-42）诱导的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）动物模型行为学以及海马和皮层的相关蛋白表达的影响，以了解 p38MAPK/糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3,GSK3）信号通路与Aβ1-42诱导认知障碍与抑郁样行为之间的关系。2.研究在小鼠海马 DG或 CA1区给予不同浓度的SO Aβ1-42诱导的小鼠认知障碍与抑郁样行为共患模型中神经肽 VGF表达的变化，为AD及 AD共患抑郁的动物模型发病机理及治疗靶点研究提供新的理论依据。
　　实验一：p38MAPK抑制剂 SB203580对 SOAβ1-42诱导的小鼠模型行为学及相关蛋白表达的影响
　　方法：ICR雄性小鼠于双侧海马CA1区注射1μg/sideSO Aβ1-42或生理盐水制作 AD动物模型及对照，手术24h后于每天固定时间腹腔注射 p38MAPK抑制剂SB203580或激动剂12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇（phorbol12-myristate13-acetate, PMA），分为七组：A组[正常对照组]、B组[SO Aβ1-42处理组]、C组[SO Aβ1-42+SB203580（0.5mg/kg）组]、D组[SO Aβ1-42+SB203580（1 mg/kg）组]、E组[SO Aβ1-42+ SB203580（2 mg/kg）组]、F组[SOAβ1-42+SB203580（4mg/kg）组]和G组[SO Aβ1-42+SB203580（2mg/kg）+ PMA（0.2mg/kg）组]，连续给药12天后开始行为学实验，包括检测学习记忆能力的新物体实验和 Morris水迷宫实验，检测抑郁样行为的强迫游泳实验和悬尾实验，行为学在每日给药后1h进行。行为学结束后取各组小鼠海马和皮层组织检测相关蛋白，包括 p-p38MAPK、p-CREB、CREB、GSK3及其不同磷酸化状态蛋白。行为学数据用GraphPad Prism5软件分析处理，蛋白表达量用OdysseyV3.0软件进行分析，并用GraphPad Prism5软件进行处理。
　　结果：1.行为学结果发现SO Aβ1-42处理组较正常对照组，出现明显的认知障碍现象，同时表现出显著的抑郁样行为；而对于学习记忆的影响只有剂量为2mg/kg的SB203580能显著改善 SO Aβ1-42引起的记忆损伤，对于抑郁样行为剂量为2和4mg/kg SB203580均能显著缓解 SO Aβ1-42引起的抑郁样行为，而激动剂 PMA却显著阻断了SB203580的作用。2.Western blot法检测海马组织的目标蛋白发现，海马中 SO Aβ1-42处理组 p-p38MAPK的表达量明显高于正常对照组，而 SB203580（2和4 mg/kg）能逆转p-p38MAPK的表达上调，而PMA显著阻断SB203580的上述作用；海马中 SO Aβ1-42处理组与正常对照组相比，p-CREB和p-Ser9-GSK3β表达显著下调，而SB203580（2及4 mg/kg）能显著逆转Aβ1-42对p-CREB和p-Ser9-GSK3β的下调作用，并且 PMA显著阻断了 SB203580的上述作用；而海马中各组间 CREB、p-Tyr279-GSK3α、p-Tyr216-GSK3β和 GSK3α/β均无显著性差异；且皮层中上述所有蛋白均未发现有显著的表达差异。
　　实验二：不同浓度 SO Aβ1-42处理海马 DG区或 CA1区对小鼠认知行为，抑郁样行为及神经肽 VGF表达的影响
　　方法：ICR雄性小鼠选择海马 DG或 CA1区微注射 SO Aβ1-42（0.5、1μg/side）或对照制作小鼠模型，分为八组：H组[DG区正常对照组]、I组[DG区 Aβ42-1处理组]、J组[DG区 Aβ1-42（0.5μg/side）]、K组[DG区 Aβ1-42（1μg/side）]、L组[CA1区正常对照组]、M组[CA1区 Aβ42-1处理组]、N组[CA1区Aβ1-42（0.5μg/side）]和 O组[CA1区 Aβ1-42（1μg/side）]，12天后开始行为学检测，结束后取各组小鼠海马检测神经肽VGF，蛋白表达量用Odyssey V3.0软件进行分析，并用GraphPad Prism5软件进行处理。
　　结果：1. SO Aβ1-42处理海马 DG或 CA1区得到相似的实验结果，行为学结果显示，在 DG或 CA1区注射1μg/side SO Aβ1-42均能显著引起小鼠记忆损伤和抑郁样行为，但在强迫游泳和悬尾实验中只有0.5μg/side SO Aβ1-42处理 DG区能显著延长不动时间，而CA1区注射0.5μg/side SO Aβ1-42却未见其显著诱导抑郁样行为。2.各组小鼠海马组织检测神经肽 VGF蛋白表达量，结果显示不论是DG还是CA1区，与正常对照组或者逆序列 Aβ42-1组相比，低剂量和高剂量的SO Aβ1-42均使其表达量显著下调。
　　结论： SB203580能够改善 SO Aβ1-42诱导的小鼠记忆损伤和抑郁样行为，其作用可能与海马组织中 p-p38MAPK、p-CREB和p-Ser9-GSK3β的表达变化有关，p38MAPK/GSK3信号通路在 SO Aβ1-42诱导的认知障碍与抑郁共患中发挥关键调节作用。其次，我们发现 SO Aβ1-42诱导小鼠记忆损伤和抑郁样行为与神经肽VGF表达改变密切相关，提示神经肽 VGF可能是一种重要的认知障碍与抑郁样行为的调控靶标，并在 AD和抑郁症的发生发展过程中扮演着重要的角色。

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引言

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

1.1.2动物处理药物

1.1.3实验试剂及耗材

1.1.4常用溶液配方

1.1.5主要实验仪器

1.2实验方法

1.2.1寡聚体Aβ1-42制备及检测

1.2.2行为学动物模型的建立及检测

1.2.3实验动物分组及药物处理

1.2.4行为学实验方法

1.2.5免疫蛋白印迹实验方法

1.2.6数据统计分析

2结果

2.1寡聚体Aβ1-42的鉴定

2.2慢病毒微注射脑区鉴定

2.3实验流程图

2.3.1实验一 Aβ1-42、SB203580或PMA药物处理及行为学流程图

2.3.2实验二 不同浓度Aβ1-42等药物处理海马不同脑区及行为学流程图

2.4实验一结果：p38MAPK抑制剂SB203580或激动剂PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型行为学的影响

2.4.1 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型在敞箱中自主活动能力的影响

2.4.2 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型在新物体识别中认知功能的影响

2.4.3 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型在强迫游泳实验中抑郁样行为的影响

2.4.4 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型在悬尾实验中抑郁样行为的影响

2.4.5 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型在Morris水迷宫实验中空间记忆的影响

2.5实验一结果：p38MAPK抑制剂SB203580或激动剂PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型海马和皮层p-p38MAPK、p-CREB、CREB、p-GSK3α/β

2.5.1 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型海马及皮层p-p38MAPK表达量的影响

2.5.2 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型海马及皮层p-CREB和总CREB表达量的影响

2.5.3 SB203580或PMA对Aβ1-42诱导的小鼠模型海马及皮层GSK3及其不同磷酸化状态表达量的影响

2.6实验二结果：不同浓度Aβ1-42处理小鼠海马DG或CA1区对小鼠认知功能，抑郁样行为及神经肽VGF表达的影响

2.6.1不同浓度Aβ1-42处理小鼠DG区和CA1区对小鼠物体识别的影响

2.6.2不同浓度Aβ1-42处理小鼠DG区和CA1区对小鼠抑郁样行为的影响

2.6.3不同浓度Aβ1-42处理小鼠DG区和CA1区对小鼠海马神经肽VGF表达的影响

3讨论

4结论

参考文献

附录 文献综述

在 学 研 究 成 果

致谢