基隆潮境公园沿海破囊壶菌多样性及其多不饱和脂肪酸研究

摘要

多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是具有非常重要的重要生物活性的一类脂肪酸，其在维持细胞膜功能，促进眼睛及大脑发育，预防心脑血管疾病等许多方面都能直接或间接得起到良好的作用。另外，多不饱和脂肪酸还是组成神经、视觉和生殖细胞膜等生物体重要器官组织的膜结构磷脂中的重要成分。然而，对于一些具有重要作用的多不饱和脂肪酸，人体自身不能合成，只能从日常膳食中摄取，特别是在了解了多不饱和脂肪酸的作用后，人们对其需求越来越大。鱼油作为传统的多不饱和脂肪酸来源，由于存在诸多限制，已经不能满足人们对多不饱和脂肪酸的需求。于是现在急需一种能够适用于工业生产的新的多不饱和脂肪酸来源。研究发现，破囊壶菌（thraustochytrids）中含有丰富的多不饱和脂肪酸，可开发成为代替鱼油的新的多不饱和脂肪酸来源，于是研究者对破囊壶菌的关注研究日益深入，特别是对红树林地区的破囊壶菌的研究。
　　本课题选择的是研究较少的海洋漂浮有机质上的破囊壶菌进行研究。采样地点在台湾基隆潮境公园地区，采集的样品主要为存在于该地区的较为丰富的藻类，另外还包括海洋中漂浮的腐木等其他有机质。采用的筛选方法为花粉诱导法，并通过ITS序列对菌种进行鉴定。经研究发现该地区的破囊壶菌主要为破囊壶菌属（Thraustochytrium）、裂殖壶菌属（Schizochytrium）和Aplanochytrium属。通过对6个月的样本分析，全年破囊壶菌在种属分布上没有明显的差异，但是2013年11月以Aplanochytrium属为主，2014年3月、7月以Thraustochytrium属为主。
　　通过对Thraustochytrium属和Schizochytrium属的破囊壶菌生物量及脂肪酸分析发现，裂殖壶菌属的生物量明显高于破囊壶菌属，而且两个属在脂肪酸组成及含量上差异也非常明显。破囊壶菌属含有高比例的二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和C16:0（软脂酸），含有少量甚至不含有二十碳四烯酸（arachidonic acid，ARA），裂殖壶菌属则含有较高的ARA。裂殖壶菌属的DHA所占比例虽然明显低于破囊壶菌属，但是由于裂殖壶菌生物量高，所以DHA的产量比破囊壶菌属的高。另外，在两个属的菌中都存在着特殊的脂肪酸，C18:1(ω-7)的脂肪酸仅存在于破囊壶菌属，在裂殖壶菌属中不含有或含量稀少，而C18:3(ω-6)、C19:1(ω-9)和C20:4(ω-3)的脂肪酸仅存在于裂殖壶菌属，在破囊壶菌属中不含有或含量稀少。这些特殊的脂肪酸或可用以作为区分这两个属菌株化学分类学的生物标志物，为菌种鉴定提供一种理论基础。
　　研究中发现了菌株MT004含有占总脂肪酸达56％以上的DHA，并且脂肪酸种类单一，易纯化，而菌株MT021则有较高的DHA、EPA、ARA产量，这两株菌皆可通过优化培养、生物工程等技术方法，提高生物量，培育为高产菌株。

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引言

1多不饱和脂肪酸及破囊壶菌研究进展

1.1脂肪酸及其分类

1.2多不饱和脂肪酸及其功能

1.3 PUFAs的来源

1.4破囊壶菌

1.5破囊壶菌生产多不饱和脂肪酸研究进展

1.6破囊壶菌的分离筛选方法

2破囊壶菌分离筛选方法建立

2.1仪器与材料

2.2样品采集

2.3实验步骤：

2.4结果及分析

2.5本章小结

3菌株ITS序列测序

3.1 DNA提取

3.2 PCR技术

3.3克隆

3.4蓝白斑筛选

3.5结果及分析

3.6本章小结

4菌种鉴定及分子系统发育分析

4.1菌种鉴定

4.2系统发育树

4.3结果及分析

4.4讨论

4.5本章小结

5脂肪酸提取及分析

5.1摇瓶发酵

5.2冷冻干燥

5.3脂肪酸提取

5.4 GC-MS分析

5.5结果及分析

5.6讨论

5.7本章小结

6结论

参考文献

在 学 研 究 成 果

致谢