沉默Musashi-2基因对B型急淋白血病细胞的抑制作用以及对LEF1表达的影响

摘要

背景与目的：
　　急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童和成人常见的造血系统恶性肿瘤之一。随着医疗技术和水平不断发展，儿童ALL治疗效果稳步提高，其5年无病生存率可达80%左右；但目前的成人治愈情况仍不乐观，如不移植，5年无病生存率不超过20%。因此，为了提高成人ALL的治愈率，必须进一步明确其发病机制、并且寻找有效分子靶点来完善其临床预后评价体系。Musashi-2（Msi2）基因首先被KHARAS等发现：其在造血系统内的原始细胞呈高水平表达，并随原始细胞的分化成熟而快速下降，提示Msi2是骨髓干细胞维持自我更新和保持多潜能性的重要调节因子。随后人们陆续在各类白血病患者中发现Msi2的高表达，但其分子作用机制仍不是很明确。有研究在造血干细胞和髓系白血病中用基因干扰和转染外源性基因的方法证实， Msi2表达与NOTCH信号途径密切相关。然而，在我们以前的研究中检测了正常人骨髓CD34+分选细胞和外周血单个核细胞（主要为成熟B淋巴细胞）的Msi2和c-Myc及HES1表达水平，发现Msi2与其它两项均呈正相关，但在成人B-ALL中， Msi2与两者的表达均没有明显相关性。此外，有研究显示Msi1过表达可以激活Wnt信号，因Msi1和Msi2有高度同源性，我们推测Msi2在B-ALL的白血病细胞中也可激活Wnt信号。因此，本研究以B-ALL细胞株NALM6为研究对象，观察Msi2沉默对细胞生长、凋亡及Wnt信号中LEF1表达影响，初步探讨Msi2在急性B型淋巴细胞白血病中分子作用机制。
　　方法:
　　（1）细胞培养：将NALM6细胞在含10%FBS的1640培养基、37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。
　　（2）Msi2 siRNA慢病毒构建：由上海汉恒生物有限公司合成。
　　（3）病毒感染和筛选：采用慢病毒（MOI=100）转染法转染小干扰片段，5μg/mL浓度的嘌呤霉素筛选细胞。荧光显微镜下观察转染效果，当细胞转染率达到90%以上即可进行细胞样本收集。
　　（4）提取细胞总 RNA：各组采集的细胞用Trizol-离心柱法提取 RNA，测定其纯度和含量，行逆转录实验做合成 cDNA。
　　（5）NALM6细胞Msi2 siRNA干扰验证：采用 PCR法检测和 western-blot法分别检测对照组和小干扰组的 Msi2基因和蛋白表达水平。并采用干扰率>60%的一组进行以下试验。
　　（6）细胞生长、凋亡及周期检测：采用 CCK-8法、Annexin V/PI及 PI法分别观察沉默 Msi2基因后对细胞增殖率、细胞凋亡和周期的影响；用Hochest染色观察细胞的凋亡情况；用 western-blot法检测细胞凋亡蛋白capase-3，PARP及细胞周期蛋白 Cyclin D1，P21的水平。
　　（7）细胞分化检测：用流式细胞仪测定 CD38和 CD10的阳性率，判断细胞的分化情况。
　　（8）采用 RT-PCR和western blot法检测观察 LEF1基因表达水平。
　　结果:
　　（1）NALM6细胞 Msi2小干扰验证：各组荧光率均达到90%以上。Msi2 siRNA1组，Msi2 siRNA2组，Msi2 siRNA3组的 Msi2 mRNA分别下调了24.48±3.65%，71.73±3.20%，33.03±3.81%。以 Msi2 siRNA2组的 Msi2基因下降最为明显，其相应的蛋白水平也明显下调，因此，用 Msi2 siRNA2组的细胞进行后续的实验。
　　（2）CCK-8法检测 Msi2小干扰后活力：Msi2 siRNA抑制 NALM6细胞生长结果显示，感染24小时后， Msi2 siRNA2组细胞活力为1.093±0.081，与无关序列对照组无明显区别（1.106±0.074， P=0.872）；72小时后，Msi2 siRNA2组细胞活力为1.343±0.064，低于无关序列对照组（1.533±0.097，P=0.048）；第七天 Msi2 siRNA2组细胞活力为2.380±0.503，明显低于无关序列对照组（3.553±0.628，P=0.038）。
　　（3）Msi2 siRNA诱导 NALM6细胞凋亡：Msi2 siRNA2组凋亡率为3.6±0.46%，稍高于无关序列组（凋亡率为0.96±0.21%），但统计学有差异P=0.015。凋亡蛋白剪切 caspase3,剪切 Parp蛋白条带有所加深但不明显。
　　（4）Msi2 siRNA阻滞 NALM6细胞周期：Msi2 siRNA2组 G0/G1期细胞比例为72.53±1.28%，高于对照组（G0/G1期比例为65.44±2.33%， P=0.0073）。并伴随相应的周期蛋白 Cyclin D1明显下调和 P21明显升高。
　　（5）Msi2 siRNA诱导 NALM6细胞分化：Msi2 siRNA2组 CD38+CD10-的细胞为62.87±2.10%， CD38-CD10+的细胞为0.67±0.21%；无关序列对照组CD38+CD10-的细胞为0.5±0.1%，CD38-CD10+的细胞为47.43±1.68%。
　　结论：
　　（1）下调Msi2表达水平能减低ALL白血病细胞活力、同时导致细胞周期阻滞并促进细胞分化，但对凋亡的影响不明显。
　　（2）在Msi2-Wnt信号通路中，随着细胞Msi2表达水平的下降，LEF1的表达水平也相应下降，提示LEF1可能参与Msi2分子作用机制。

目录

引言

一Musashi 基因家族

二 Wnt信号通路与 LEF1基因

三 Msi-2与Wnt信号通路

1 材料与方法

1.1主要仪器

1.2主要实验材料及试剂

1.3实验方法及步骤

1.3.1 NALM6细胞培养

1.3.2 Msi2 siRNA慢病毒构建

1.3.3慢病毒转染及筛选

1.3.4提取细胞总 RNA

1.3.5逆转录实验

1.3.6荧光定量 PCR扩增实验

1.3.7 Western blot 检测

1.3.8 CCK-8测各组的生长情况

1.3.9 AnnexinV/PI测细胞凋亡率：

1.3.10 PI测细胞周期：

1.3.11Hoechst 染色

1.3.12CD38和CD10检测

2 实验结果

2.1 NALM6细胞Msi2 siRNA小干扰验证

2.2 Msi2 siRNA 抑制NALM6细胞生长

2.3 Msi2 siRNA 诱导NALM6细胞凋亡

2.4 Msi2 siRNA阻滞NALM6细胞周期

2.5 Msi2 siRNA诱导NALM6细胞分化成熟

2.6 Msi2 siRNA 抑制NALM6细胞生长分子机制

3 讨论

4 结论与不足

参考文献

在学研究成果

致谢