外源雄性激素对香鱼性激素水平及性别调控相关基因表达的影响

摘要

香鱼（Plecoglossus altivelis）是中国名贵、特色鱼类养殖种类之一，具有较高的经济价值。与雄性个体相比，香鱼雌鱼不仅生长速度快、销售期长，而且怀卵香鱼的市场价格更高，对香鱼进行性别调控和全雌单性群体繁育技术研究既有理论意义又有应用价值。与其他高等脊椎动物相比，鱼类的性别可塑性比较大，在性别决定期甚至性腺分化后都容易受到外界因素的干扰而影响鱼体的性别和生殖机能。水体中的外源性激素可干扰鱼体自身的性激素水平、性别及生殖相关基因表达、以及性腺发育，从而影响生殖机能。 为了解外源雄性激素对香鱼性别和生殖机能的影响，为后续开展功能性雄鱼诱导和全雌群体繁育奠定基础，本研究检测了甲基睾酮（MT）对香鱼血清雄激素和雌激素水平的影响，而这种血清性激素水平的改变可能与相关基因表达变化有关，因此在本研究团队已克隆Cyp19ala、Dmrt1等性别相关基因基础上，继续克隆了香鱼foxl2基因，并检测了MT处理后foxl2、Cyp19ala、Dmrt1等性别相关基因的表达变化。 研究结果表明，与对照组（0μg/g）相比，MT处理后低浓度组（10μg/g）和中浓度组（50μg/g）雌性香鱼血清中E2的含量均降低，其中第3d的中浓度组降为对照组的57.14%，而第5d的中浓度组降为对照组的77.27%；低浓度组（10μg/g）、中浓度组（50μg/g）、高浓度组（100μg/g）雄鱼血清E2的含量也均出现显著降低，3d时分别比对照组降低了75.36%、65.92%和68.09%。MT注射后雌、雄香鱼血清中睾酮（T）的水平均显著升高，并呈一定的剂量相关性，其中第1d高浓度组（100μg/g）雌、雄血清中的T水平分别升高为对照组的4.65倍和5.53倍。MT注射后3d和5d时，3个实验组香鱼血清T浓度均比1d时有所降低，其中低浓度组与对照组相比变化不大，而中浓度组和高浓度组的血清T水平仍显著高于对照组（P＜0.05）。 获得香鱼foxl2基因cDNA序列，长度为2199bp，开放阅读框（ORF）序列长度为918bp，预测编码蛋白质包含305个氨基酸，包含forkhead（FH）结构域。系统进化树分析显示该基因位于foxl2大簇中，与虹鳟、大西洋鲑进化关系较近，序列相似性分别为96.1%和95.4%。多重序列比对显示香鱼foxl2基因与大西洋鲑和虹鳟的foxl2基因具有高同源性，与鲈鱼、尼罗罗非鱼和青鳉的同源性分别为95.7%、95.0%和93.8%。RT-PCR检测结果显示foxl2基因在香鱼雌鱼卵巢中表达量最高，在鳃和脑中有中等程度表达，在雄鱼鳃中表达较高，脑中微弱表达，在皮肤、心脏、肝、脾、肾、胃、肠和肌肉中未检测到表达。 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测显示：外源雄激素（MT）注射后，雌性和雄性香鱼性腺组织中foxl2表达量整体趋势出现了显著的抑制效果，特别是在MT注射后第3d，中浓度组（50μg/g）卵巢和睾丸中foxl2表达量均较对照组下降了63.73%、98.02%（P＜0.05）。Dmrt1基因在香鱼卵巢和睾丸中都有表达，并显著上升。不同浓度MT注射3d后，低浓度组（50μg/g）中雌、雄香鱼性腺中Dmrt1基因较对照组上升了0.78倍、1.90倍。不同浓度MT注射5d后，使雄性香鱼性腺中Dmrt1基因的表达略微升高，而在雌性香鱼性腺中其作用刚好与雄鱼中的Dmrt1基因作用相反，起到了抑制Dmrt1基因的表达的作用，由此也可启示，通过MT注射可以抑制雌鱼性腺的发育。MT浓度不同及注射时间段不同对Cyp19ala基因的表达既有抑制作用也具促进作用，总体来看，高浓度组对雌性香鱼性腺中Cyp19ala基因的表达呈抑制作用，在雄性香鱼性腺中未检测到Cyp19ala基因的表达。MT注射对香鱼foxl2、Cyp19ala和Dmrt1基因的表达均产生了影响，但不同的MT注射浓度及取样时间点可能表现为促进或抑制foxl2、Cyp19ala和Dmrt1基因的表达。 综上所述，外源雄性激素（MT）可使香鱼雌鱼和雄鱼血清雄性激素（T）水平的升高和雌性激素（E2）水平的降低，而性激素水平的改变可能与外源雄性激素处理所引起的foxl2、Dmrt1和Cyp19ala等性别相关基因的表达变化有关。研究结果既对香鱼性别调控与全雌鱼繁育实践具有重要的指导意义，又为深入阐明性别相关基因在香鱼性腺中的调控功能奠定了基础。

目录

声明

引言

1文献综述

1.1鱼类性腺发育相关基因

1.1.1 Dmrt基因家族

1.1.2芳香化酶基因

1.1.3 TGF-β超家族

1.1.4 Sox基因家族

1.2鱼类性别决定类型及外源因子作用的研究

1.2.1鱼类性别决定

1.2.2外源性激素对性别决定类型及性腺分化的影响

2外源雄性激素对香鱼性激素水平的影响

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂与配方

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1样品采集

2.2.2血清性激素水平检测

2.2.3数据处理

2.3结果

2.3.1血清雄激素浓度变化

2.3.2血清雌激素浓度变化

2.4讨论

3香鱼foxl2基因克隆、序列分析及其组织表达检测

3.1实验材料

3.1.1实验动物

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.2实验方法

3.2.1 总RNA提取

3.2.2引物设计

3.2.3序列验证

3.2.4 PCR产物切胶纯化回收

3.2.5 3’RACE扩增

3.2.6序列分析及系统进化树构建

3.2.7组织表达检测

3.3结果

3.3.1 foxl2基因序列特征

3.3.2氨基酸序列比对和系统进化分析

3.3.3 foxl2基因在香鱼各组织中的表达

3.4讨论

4外源雄性激素对香鱼性腺中性别相关基因表达的影响

4.1实验材料

4.1.1实验动物

4.1.2主要试剂与配方

4.1.3主要仪器

4.2实验方法

4.2.3引物设计

4.2.4实时荧光定量PCR

4.3结果

4.3.1外源雄性激素对香鱼性腺中foxl2基因表达的影响

4.3.2外源雄性激素对香鱼性腺中Dmrt1基因表达的影响

4.3.3外源雄性激素对香鱼性腺中Cyp19ala基因表达的影响

4.4讨论

5.1结论

5.2展望

参考文献

在学研究成果

致谢