五羟色胺缺失小鼠损毁胆碱能神经元对抑郁样行为的影响

摘要

目的：抑郁症与胆碱能神经系统异常密切相关，有证据表明胆碱能M受体拮抗剂具有快速改善抑郁样症状。5-羟色胺（5-HT）缺乏为主的单胺类假说仍是目前比较公认的抑郁症发病机制的主要科学假说。胆碱能与5-HT能系统之间的相互作用在抑郁症中的作用机制尚不明确。本研究通过特异性损毁大鼠斜角带核水平支胆碱能神经元来诱导动物抑郁样行为；通过化学遗传方式特异性地抑制斜角带核水平支（HDB）到齿状回（DG）的胆碱能投射通路，来探究胆碱能神经系统在抑郁样行为发生中的作用。特异性损毁5-羟色胺缺失工具小鼠的斜角带核胆碱能神经元，深入探究5-HT与胆碱能神经元之间的交互作用对抑郁症发病中抑郁样行为产生的影响。 实验一：特异性毁损斜角带核水平支的胆碱能神经元对SD大鼠和野生型C57小鼠抑郁样行为的影响 方法：成年的雄性SD大鼠随机分成三组：空白对照组，假手术PBS组和神经免疫毒素皂草素（192IgG-Saporin）组。分别对假手术PBS组和神经免疫毒素皂草素组的大鼠进行脑立体定位实验，假手术PBS组在斜角带核水平支（AP:+0.48mm，ML:±0.8mm，DV:-8.0mm）核团处微量注射0.5μl的PBS，神经免疫毒素皂草素组在斜角带核水平支（AP:+0.48mm，ML:±0.8mm，DV:-8.0mm）核团处微量注射0.5μg/μl的神经免疫毒素皂草素，空白对照组不做处理。2周后对所有大鼠进行糖水偏好、强迫游泳、旷场实验、高架十字迷宫实验等行为学实验。最后处死SD大鼠灌流取脑切片进行免疫荧光染色实验来检测斜角带核水平支ChAT阳性细胞数目和海马的锥体细胞及颗粒细胞厚度的改变。 将成年雄性野生型C57小鼠随机分成三组：空白对照组，假手术PBS组，神经免疫毒素皂草素组。分别对假手术PBS组和神经免疫毒素皂草素组的野生型C57小鼠进行脑立体定位实验，假手术PBS组在斜角带核水平支（AP:+0.74mm，ML:±0.625mm，DV:-4.75mm）核团处微量注射0.25μl的PBS，神经免疫毒素皂草素组在斜角带核水平支（AP:+0.74mm，ML:±0.625mm，DV:-4.75mm）核团处微量注射0.25μg/μl的神经免疫毒素皂草素，空白对照组不做处理。2周后对所有小鼠进行糖水偏好，旷场实验，新事物辨别实验，悬尾实验，强迫游泳等行为学实验。待行为学实验结束后处死小鼠，固定脑组织切片进行免疫荧光染色实验，观察ChAT阳性细胞数目和海马的锥体细胞及颗粒细胞厚度的改变。 结果：三组SD大鼠术后恢复2周后进行了糖水偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验、高架十字迷宫实验的测试，结果显示特异性地毁损斜角带核水平支胆碱能神经元的神经免疫毒素皂草素组大鼠的糖水偏好百分比相较于对照组明显降低（P＜0.01），强迫游泳不动时间明显延长（P＜0.01），在旷场实验中的穿线次数以及直立次数均明显减少（P均＜0.05），而假手术PBS组和空白对照组之间则没有明显的统计学差异。这些结果提示特异性地毁损斜角带核水平支的胆碱能神经元能导致SD大鼠产生抑郁样行为。免疫荧光染色结果显示神经免疫毒素皂草素组大鼠的斜角带核水平支中ChAT阳性细胞数目显著减少（P＜0.01），与假手术PBS组大鼠相比，神经免疫毒素皂草素组大鼠海马中锥体细胞及颗粒细胞厚度厚度明显减少。 三组野生型C57小鼠术后恢复2周后进行了糖水偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验、高架十字迷宫实验、新事物辨别实验、悬尾实验的测试，结果显示特异性地毁损斜角带核水平支胆碱能神经元的神经免疫毒素皂草素组C57小鼠的糖水偏好百分比相较于对照组明显降低（P＜0.01），强迫游泳不动时间明显延长（P＜0.01），悬尾实验中不动时间明显延长（P＜0.01），在旷场实验中的穿线次数明显减少（P＜0.01）。而假手术PBS组和空白对照组之间则没有明显的统计学差异。这些结果表明特异性地毁损斜角带核水平支的胆碱能神经元能导致野生型C57小鼠产生抑郁样行为。免疫荧光染色结果显示神经免疫毒素皂草素组野生型C57小鼠的斜角带核水平支中ChAT阳性细胞数目显著减少（P＜0.01），与假手术PBS组野生型C57小鼠相比，神经免疫毒素皂草素组野生型C57小鼠海马中锥体细胞及颗粒细胞厚度厚度明显减少。 实验二：化学遗传抑制HDB区到DG区的胆碱能投射对SD大鼠抑郁行为的影响 方法：将成年的雄性SD大鼠随机分成三组：空白对照组，假手术组，化学遗传抑制组。空白对照组不做任何处理，假手术组在双侧斜角带核水平支(HDB)处(AP:+0.48mm，ML:±0.8mm，DV:-8.0mm)注射pAAV-ChAT-mini-TK-promoter-EGFP-2A-Cre和pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry腺相关病毒混合物，每侧体积均为1μl，注射时间5min，留针5min，之后在双侧DG（AP:-3.8mm，ML:±1.6mm，DV:-3.75mm）埋置立体定位套管；化学遗传抑制组同样也在双侧斜角带核注射pAAV-ChAT-mini-TK-promoter-EGFP-2A-Cre和pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry腺相关病毒混合物，病毒注射的体积和时间均与假手术组相同，同时也在双侧DG（AP:-3.8mm，ML:±1.6mm，DV:-3.75mm）埋置立体定位套管。假手术组及化学遗传抑制组SD大鼠术后青霉素抗感染3d，待病毒转染3w后抑制组大鼠在DG区注射0.5μl1mM的叠氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，CNO），30min后对所有SD大鼠进行高架十字迷宫实验，强迫游泳实验，糖水偏好实验，旷场实验测试。测试完成后处死大鼠灌流取脑组织切片进行免疫荧光染色观察病毒转染情况。 结果：海马DG区注射0.5μl CNO激活DREADD-hM4Di抑制HDB区到DG区的胆碱能投射神经元，结果显示抑制组大鼠强迫游泳的不动时间显著延长（P＜0.01），旷场实验中穿线次数以及直立次数均减少（P均＜0.05），旷场实验中大鼠走出第一格潜伏期时间减少（P＜0.05），而假手术组和空白对照组大鼠之间则没有明显的统计学差异，结果提示化学遗传抑制HDB区到DG区的胆碱能投射能使大鼠产生抑郁样行为。 实验三：特异性毁损斜角带核胆碱能神经元对Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠抑郁样行为的影响 方法：选用Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠，这种小鼠通过诱导Cre-LoxP系统选择性地灭活成年小鼠中缝核中Lmx1b的表达，其5-HT水平相比于正常小鼠下降了60%。通过Pet1-creER/Flox-lmx1b+/-基因型小鼠交配繁殖，小鼠出生后1个月标记剪尾，裂解样本，PCR扩增DNA，进行琼脂糖凝胶电泳检测，对比条带，确定Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠。 成年雄性Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠随机分为三组：空白对照组，假手术组，神经免疫毒素皂草素组。假手术组和神经免疫毒素皂草素组Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠行脑立体定位实验，假手术组在斜角带核水平支（AP:+0.74mm，ML:±0.625mm，DV:-4.75mm）核团微量注射0.25μl的PBS，神经免疫毒素皂草素组在斜角带核水平支（AP:+0.74mm，ML:±0.625mm，DV:-4.75mm）核团微量注射0.25μg/μl的神经免疫毒素皂草素，空白对照组不做处理。2周后对所有小鼠进行糖水偏好，旷场实验，新事物辨别实验，悬尾实验，强迫游泳等行为学实验。行为学实验结束后对Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠进行灌流固定脑组织，切片行免疫荧光染色，观察ChAT阳性细胞数目和海马的锥体细胞及颗粒细胞厚度的改变。 结果：三组Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠术后恢复2周后进行糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾试验、旷场实验、高架十字迷宫实验的测试，对特异性毁损斜角带核水平支胆碱能神经元对Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠的行为学数据进行分析，并未发现明显的统计学差异，但在旷场实验中直立次数有所减少，悬尾实验的不动时间稍延长。免疫荧光染色结果显示神经免疫毒素皂草素组Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠的斜角带核水平支中ChAT阳性细胞数目显著减少（P＜0.05），且与假手术组Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠相比，神经免疫毒素皂草素组Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠海马中锥体细胞及颗粒细胞厚度没有明显改变，提示损毁Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠斜角带核水平支胆碱能神经元没有表现出抑郁样行为，可能与海马区的神经发生有关。 结论：特异性损毁大鼠小鼠斜角带核水平支胆碱能神经元以及选择性地抑制HDB区到DG区的胆碱能投射通路可以导致抑郁样行为；5-HT缺失小鼠损毁斜角带核水平支胆碱能神经元后既不产生抑郁样行为，也不影响海马的锥体细胞及颗粒细胞厚度，可能与5-HT缺失小鼠海马区神经发生有关。

目录

引言

1实验材料

1.1实验动物

1.2实验试剂与器材

1.2.1实验试剂

1.2.2实验耗材

1.2.3实验设备

1.3溶液配制

2实验方法

2.1大鼠、小鼠脑立体定位实验及斜角带核水平支核团微量注射手术

2.2糖水偏好实验（ Sucrose Preference Test, SPT）

2.3旷场实验（ Open filed test, OFT）

2.4新物体识别实验（ Novel Object Recognition Test, NORT）

2.5高架十字迷宫实验（ Elevated plus maze, EPM）

2.6悬尾实验( Tail suspension experiment, TST)

2.7强迫游泳实验（ Forced Swimming Test, FST）

2.8小鼠的基因型鉴定

2.9灌流取脑及脑组织固定

2.10免疫荧光实验

2.11尼氏染色实验

2.12图像获取和分析

2.13数据分析

3实验安排

3.1实验一：特异性毁损斜角带核水平支的胆碱能神经元对SD大鼠和野生型C57小鼠抑郁样行为的影响

3.2实验二：化学遗传抑制 HDB区到 DG区的胆碱能投射对 SD大鼠抑郁行为的影响

3.3实验三：特异性毁损斜角带核胆碱能神经元对 Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠抑郁样行为的影响

4实验结果

4.1实验一：特异性毁损斜角带核水平支的胆碱能神经元对SD大鼠和野生型C57小鼠抑郁样行为的影响

4.1.1斜角带核水平支的胆碱能神经元毁损对SD大鼠抑郁样行为的影响

4.1.2 SD大鼠斜角带核水平支胆碱能神经元的损毁情况

4.1.3斜角带核水平支的胆碱能神经元损毁后SD大鼠海马的形态学变化

4.1.4斜角带核水平支的胆碱能神经元毁损对野生型C57小鼠抑郁样行为产生的影响

4.1.5野生型C57小鼠斜角带核胆碱能神经元的损毁情况

4.1.6斜角带核胆碱能神经元损毁后C57小鼠海马形态学变化

4.2实验二：化学遗传抑制 HDB区到 DG区的胆碱能投射对 SD大鼠抑郁行为的影响

4.2.1斜角带核水平支化学遗传抑制 HDB 到 DG 的胆碱能投射对大鼠抑郁样行为的影响

4.2.2立体定位套管埋置部位确认

4.2.3病毒转染情况

4.3实验三：特异性毁损斜角带核胆碱能神经元对 Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠抑郁样行为的影响

4.3.1斜角带核水平支胆碱能神经元毁损对 Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠抑郁样行为的影响

4.3.2 Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠斜角带核胆碱能神经元的损毁情况

4.3.3斜角带核水平支胆碱能神经元损毁后 Pet1-CreER/Flox-lmx1b-/-小鼠海马形态学变化

5讨论

6结论

参考文献

附录A 主要缩略词中英文对照表

在学研究成果

致谢

附录B 综述:大麻的成瘾性和潜在的药用价值