建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的细胞分子生物学和免疫学研究

摘要

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）是侵染兰花最常见的两种病毒。它们使兰花叶片形成褪绿条纹、凹陷的灰白斑或坏死圈斑等症状，导致植株生长不良、开花小而少，花期缩短，给花卉生产造成严重损失。CymMV隶属线形病毒科（Flexiviridae）、马铃薯X病毒属（Potexvirus），病毒RNA基因组全序列约6-7 kb，与该同属的其它成员有很高的同源性。整个基因组由5个开放读码框架（ORF）构成，其中CP基因是完整地ORF5框，长约700nt，编码24kD的外壳蛋白。ORSV隶属烟草花叶病毒属（Tobamovirus），病毒RNA基因组全序列约5-6 kb，含有4个ORF，CP基因是完整的ORF4，长约600nt，编码17kD的外壳蛋白。
　　通过负染和超薄切片观察到蝴蝶兰（P. amabilis）病叶中线状和杆状病毒颗粒。进一步的组织切片观察，同时发现两种病毒的典型聚集体：CymMV呈带状聚集体，粒子多层排列，层间成一定角度或螺旋相叠；ORSV聚集体呈平行、角层状或螺旋型排列。二种病毒聚集体均出现于薄壁细胞、细胞间隙和维管束中，感病细胞中叶绿体发育不全；线粒体增生、肿胀甚至空化；细胞核膨大、空化。通过建立多重 RT-PCR体系，同时扩增到建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）的外壳蛋白基因。经序列测定和同源性比对，与GenBank已知分离物同源性分别达到98％和99-100%。从细胞和分子层面共同揭示了CymMV与ORSV复合侵染兰科植物后细胞超微结构病变特征。同时为两种病毒的复合侵染提供快速直接的鉴定依据。
　　用RT-PCR方法获得了CymMV和ORSV外壳蛋白基因，将两个基因片段分别插入原核表达载体 pET32c，构建载体 pET32c-CymMV-CP和pET32c-ORSV-CP并转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后获得了重组蛋白表达，Western blotting分析证实表达产物具有免疫反应性。根据Western blot结果，将含两种重组质粒的重组菌大量表达，并通过镍琼脂糖凝胶纯化蛋白，免疫家兔，制备了CymMV和ORSV的多克隆抗体，并通过ELISA测定了抗体效价。
　　总之，本研究从细胞层面、分子层面及免疫学层面对CymMV和ORSV进行了初步研究。探讨了感染这两种病毒的植物组织超微结构病变，建立了多重RT-PCR鉴定体系，为这两种病毒的快速鉴定提供依据。原核表达了病毒外壳蛋白并制备了多克隆抗体，为CymMV和ORSV病毒诊断试剂盒的开发奠定了基础。

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第一章 兰科植物病毒生物学研究进展

1 兰科植物病毒简介

2． 常用兰科植物病毒检测方法

3．抗病毒基因工程研究进展

4 展望

第二章 感染建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）的兰花超微结构病变研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

第三章 建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）的分子鉴定

1 材料与方法

2 结 果

3讨 论

第四章 建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因原核表达及多克隆抗体的制备

1 材料与方法

2 结 果

3讨 论

研究总结

参考文献

附录A：常用试剂及配制

附录B：染 色 液 配 方

附录C：固 定 液 配 方

附录D 包埋剂配方

致谢