KLF6基因在肝癌中遗传不稳定性及临床病理关系的研究

摘要

研究背景：
　　 肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为,肿瘤细胞是单克隆性的,即一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症(cancer)[1]。癌症是全球导致死亡的主要因为之一；世界卫生组织2010年2月警告说,如果人们不认真采取措施预防癌症,到2030年全球每年的癌症死亡人数将可能在现有基础上翻番,达1700万。目前全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症,这比艾滋病、结核病和疟疾导致的死亡人数总和还要高。而且,每年全球还有超过1200万人被确诊患上癌症。新发癌症中,男性789620例,前三位是前列腺癌(28％)、肺癌(15％)和直肠癌(9％),女性739940例,前三位是乳腺癌(28％),肺癌(14％)和直肠癌(10％)。癌症是一种多步骤过程的结果,主要是由控制细胞生长的主要基因先后累积突变导致的[2]。遗传不稳定性在人类癌症发展史上占据着核心作用。由于正常的体细胞突变率极低,人们一致认为,基因的遗传不稳定性伴随基因突变率增加是癌症发生的基础[3]。因此,研究肿瘤的发生及转移机制为临床提供可靠的治疗及预后指标。
　　 研究表明,原癌基因的激活和抑癌基因的失活是导致肿瘤发生的两个重要因素,尤其是抑癌基因的失活与肿瘤发生的关系更为密切[4]。肿瘤抑癌基因(tumorsuppressor gene,TSG)又称隐性癌基因,需等位基因两个位点均发生突变或缺失才会发生功能障碍,即隐性纯合或杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)时才会导致癌的发生[5]。抑癌基因变异最常见的分子机制是其2个位点相继因点突变和LOH而导致功能完全丧失,即广为接受的Knudsen“两次打击理论”[6]。大量研究显示基因的遗传不稳定性,即微卫星不稳定性(microsatelliteinstablility,MSI)和LOH,可能是使抑癌基因失活的重要因素,由此导致基因突变和肿瘤的发生.
　　 微卫星是20世纪80年代后期分离出来一种比小卫星DNA具有更短重复单元的卫星DNA,又被称作短串连重复或简单重复序列,每单元长度在1～6bp之间根据,重复单元的构成与分布,由2～6个核苷酸组成,具有高度多态性的简单串联核苷酸重复序列,微卫星DNA序列被分为3种类型:单一型,复合型和间断型。MSI是指由于启动MLH1、MSH2或较少MSH6甲基化导致的DNA错配修复缺陷,这种缺陷可导致微卫星的增多或减少。因此,MSI可导致肿瘤相关基因的突变,可能是引发肿瘤的重要机制。若DNA复制错误的结果是等位基因片段的的缺失,则导致LOH的发生。LOH是肿瘤染色体上的一对等位基因缺失,DNA多态性基因座中的一个发生缺失,就失去杂合性。LOH是指与抑癌基因相关的杂合性微卫星位点常伴有等位基因酌丢失。而目前分析LOH已成为检测抑癌基因失活、发现和定位新的肿瘤抑制基因的重要手段之一[7]。由于LOH存在于在杂合体中,因此,如果在标记体细胞DNA多态性显示有杂合性,则在肿瘤细胞中就可观察到LOH[8]。
　　 Kruppel样因子6(Kruppel-like factor6,KLF6),又称ZF9/CPBP,是近年发现的锌指转录因子。KLF6基因位于人类染色体图谱的10号染色体短臂(10p15),由4个外显子组成,分别为218、574、124、525bp,突变常发生在2、3外显子,其中外显子2编码KLF6蛋白的转录活性域。核转录因子KLF6是一种损伤后修复基因,对TGF—β1及其受体具有反式激活作用,该基因具有典型的DNA结合域及转录激活域,激活后能移位入核反式作用于富含GC盒的DNA序列结合元件的启动子,在转录水平调控其下游多种靶基因的表达[9]。已发现在多种人类肿瘤中如,前列腺癌、结肠癌、肝细胞癌等组织中不同程度存在KLF6基因缺失或突变,并且失去了其抗细胞增殖能力,因此被认为是一新的抑癌基因[10-12]。研究KLF6基因遗传不稳定性与肝癌临床病理特性的关系,对于了解KLF6与肝癌发生的作用及其与肝癌的转移机制,有着重要临床意义。
　　 研究目的：
　　 了解微卫星不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)在肝癌中的作用机制,研究KLF6基因D1716、M1、M2、M4位点在肝癌中的遗传不稳定性,及MSI和LOH对肝癌组织蛋白表达的影响,阐明KLF6基因遗传不稳定性与肝癌发生、发展的关系,为揭示KLF6作为抑癌基因与肿瘤发生发展的作用机制,提供理论依据。
　　 研究方法：
　　 (1)苯酚-氯仿抽提法,提取石蜡包埋的肝癌组织基因DNA。(2)PCR-单链构象多态性(SSCP)、常规银染检测KLF6位点的遗传不稳定性。(3)Envision免疫组织化学染色检测KLF6的蛋白表达。(4)Imagepro Plus计算机图像分析软件分析蛋白表达。(5)SPSS软件统计分析相关性。
　　 研究结果：
　　 肝癌KLF6基因微卫星位点LOH的检出率为35.71％(10/18),与肝癌患者年龄、分化程度、包膜的有无无相关性,但与临床TNM分期密切相关(P<0.01),LOH在肝癌Ⅲ+Ⅳ期检出率为75.00％(6/8)明显高于Ⅰ+Ⅱ期的20.00％(4/20)。MSI检出率为17.86％(5/28)。MSI与肝癌患者的年龄、肝癌的分化程度、淋巴转移、临床TNM分期和包膜有无均无相关性。KLF6在正常组织中不表达或者低表达；肝癌中KLF6蛋白阳性检出率为50.00％(14/28),与患者年龄、肝癌淋巴转移、临床TNM分期和包膜的有无均无相关性,在KLF6蛋白表达阳性的肿瘤中LOH阳性率为7.14％(1/14),显著低于LOH阴性组的64.29％(9/14)的表达率(P<0.01)。
　　 结论：
　　 KLF6基因的遗传不稳定性可能是肝癌发生发展的一个重要机制,MSI和LOH通过不同的途径调控肝癌的发生和发展,KLF6基因LOH的发生率与淋巴转移正相关。LOH在KLF6杂合性缺失的过程中起了重要作用,可作为肝癌恶化及进展的一个指标,MSI则影响到肿瘤的预后,二者对KLF6蛋白表达的影响表明KLF6不仅是个肿瘤抑制基因,而且是肿瘤转移抑制基因。

目录

文摘

英文文摘

致谢

前言

英文缩略词

1 材料与方法

1.1 病例及临床资料

1.2 主要试剂

1.3 抗体及引物

1.4 缓冲液及溶液配制

1.5 主要仪器

1.6 DNA抽提及处理

1.7 聚合酶链反应

1.8 单链构象多态性分析

1.9 银染

1.10 判断标准

1.11 ENVISION免疫组织化学染色

1.12 免疫组织化学图像判断标准

1.13 图像分析

1.14 统计学分析

2 结果

2.1 MSI和LOH检测分析结果

2.2 KLF6蛋白免疫组织化学染色结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:转录因子KLF6在肿瘤中的作用机制

参考文献

攻读硕士期间主要科研成果

主持以及参与课题