目的:应用超声造影(Contrast-enhanced Ultrasound,CEUS)及其量化技术定量评估兔肾缺血再灌注损伤,并比较肾皮质时间-强度曲线(timeintensity curve,TIC)各参数与其肾组织ICAM-1(Intercellular-AdhesionMolecule-1,ICAM-1)表达量的相关性,探讨了超声造影在肾缺血再灌注损伤中的诊断价值。 方法:24只健康新西兰家兔随机分组,按照时间点的不同,分为对照组(I0)、缺血再灌注组,其中按再灌注时间的不同分为再灌注24h组(I24h)、再灌注3d组(I3d)、再灌注5d组(I5d)共4组,每组6只。术前剪去兔肾区兔毛,用二维狄阶超声观察兔肾位置并作标记,随后于兔腿肌肉最丰富处肌肉注射速眠新Ⅱ进行个身麻醉,用酒精棉球作双肾区局部皮肤消毒后进行无菌操作。对照组只切除右肾,左肾不予处理,关腹。行超声检查。I24h、I3d、I5d3个组的18只兔行右肾切除术后,分离左肾,用无创动脉夹夹闭左肾肾蒂血管造成缺血,观察到肾脏由鲜红色迅速变暗红,表明缺血成功,开始计算缺血时间。一小时后松开动脉央,观察肾脏由暗红变鲜红,表示再灌注成功,即刻开始计算缺血再灌注时间。关腹,室温清洁饲养。分别于24h、3d、5d不同时间点行包括二维、彩色多普勒(color Doppler flow imaging,CDFI)、能量多普勒(power Doppler imaging,PDI)及超声造影(CEUS)在内的超声检查。比较不同检查状态下的肾血液灌注。分析谐波状态下超声造影模式及定量分析软件(Wash in／Wash out)所得肾皮质不同部位回声的时间-强度曲线(TIC)。参数包括开始增强时间(arrival time,AT),灌注峰值时间(time to peak,TIP),灌注峰值强度变化(difference between Band the intensitv at t=0,A),曲线下面积(Area under the curve,Area),曲线上升支斜率(gradient between start frame to peak frame,Grad)。每组超声造影检测完毕后即刻处死大白兔,低温下取部分肾皮质组织行病理切片检查。取部分于-60℃冷藏,基于双抗体夹心技术,严格按照酶联免疫检测试剂盒测得各组兔肾皮质组织细胞粘附分子-1表达含量,并分析其与超声造影TIC曲线血参数的相关性。组间、组内参数的比较采用单因素方差齐性分析检验,不同组别间TIC曲线各参数与对应肾组织ICAM－1表达含量关系采用直线相关分析,计算其相关系数r值,以P<0.05为差异有统计学意义。 结果:实验中所有兔子麻醉显效良好,造模顺利,造影时均在完全清醒状态下进行。(1)常规二维超声检查显示兔肾形态规则,距体表深约1.3-1.8cm,大小约(2.85±1.03)x(2.23±0.67)cm2,包膜完整,实质回声均匀,CDFI和PDI均能显示兔肾呈“树枝状”分布的血管分支。且脉冲多普勒(Pulsed wave Doppler,PW)能检测出兔肾动脉血流动力学改变,但CDFI不能清晰显示弓形动脉以其以下动脉的血流灌注,PDI虽能显示包膜下血流灌注,但是无量化刻度指标。(2)谐波状态下超声造影结果:①对照组:经耳缘静脉快速团注造影剂SonoVue3—8s后,造影剂快速从肾窦达肾包膜下,按肾段动脉、叶间动脉、弓形动脉、肾皮质、肾髓质、肾窦依次强化,至整个左肾形成“火球样”增强后,约35-50s开始消退,消退次序同前,但是肾皮质消退最迟。②缺血再灌注组:增强模式同前,肉眼观察开始增强时间及消退时间均延长,但是差别不大。(3)TIC曲线参数分析①I0组:肾皮质TIC曲线表现为急速上升达峰值后快速下降,参数分别如下:A(15.027±13.488dB)、AT(8.628±1.546s)、TTP(4.671±0.853s)、Area(630.573±137.793dBs)、Grad(4.176±0.2911 dB／s);②I24h组:TIC曲线表现为上升速度缓慢,下降速度缓慢,参数如下:A(16.626±15.271dB)、AT(12.806±4.011s)、TTP(18.187±4.172s)、Area(971.799±206.877dBs)、Grad(1.498±1.460 dB／s):③I3d组:TIC曲线表现为上升速度较慢,下降速度更慢,参数如下:A(15.846±16.233dB)、AT(13.492±4.978s)、TTP(23.692±7.232s)、Area(939.190±393.443dBs)、Grad(1.196±0.977 dB／s)；④I5d组:TIC曲线表现为上升速度较I24h组和I3d组快,但不及I0组,下降速度也相同。参数如下:A(18.655±15.835dB)、AT(10.567±3.849s)、TTP(13.313±3.913s)、Area(964.248±300.197dBs)、Grad(2.014±0.474 dB／s)。组间比较发现:①TTP和AT值组间比较变化趋势一致:再灌注组均比正常对照组延长,而再灌注24h到再灌注3d时呈增高趋势,并在第三天时达高峰,再灌注第3d到再灌注第5d呈缩短趋势,但是再灌注5d时仍比正常对照组时间长,差别有统计学意义(P<0.05)。②Grad值各组间比较,差别非常显著(P<0.01):缺血再灌注组与对照组比较斜率均明显降低,而且再灌注组间差别也非常显著。缺血再灌注3d时曲线Grad值最低,上升缓慢,再灌注5d时回升,表现上升加速,但仍慢于正常对照组；③Area值缺血再灌注组较对照组明显升高(P<0.01),但是缺血再灌注组间无明显差异(P>0.05)。④A值各组间比较无明显变化(P>0.05),无统计学意义。(4)病理检查结果:正常对照组肾单位显示清晰,肾小管、肾小球排列整齐；再灌注24小时组,兔肾肾小管上皮细胞体积增大,至空泡形成,以气球样变性为主。间质内淋巴细胞明显增加,炎症浸润明显；再灌注3d组,兔肾肾小管管腔扩张,部分上皮细胞出现核浓缩、核破碎及核溶解现象,呈凝固性坏死,同时坏死区周边出现充血和炎症反应带,间质水肿明显,可见大量淋巴细胞浸润；再灌注5d组,肾小管管腔扩张,管腔内可见少些细胞管型,仪少数上皮细胞见变性及坏死,新生毛细血管数量增多,间质水肿,可见淋巴细胞。(5)标准品的浓度及对应的OD值计算出了标准曲线直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。肾皮质ICAM－1表达含量结果如下:I0组(29.272±5.257ng／ml),I24h组(58.770±6.599ng／ml),I3d组(80.120±10.539ng／ml),I5d组(50.676±6.319ng／ml)。缺血再灌注组含量较对照组均明显升高,P<0.05,差异有统计学意义。缺血再灌注组间比较,I3d组最高,I5d组下降,虽低于I24h组但仍高于对照组,且组间比较差别显著(P<0.01),有统计学意义。(6)各组TIC曲线参数分别和肾皮质ICAM-1表达含量的直线相关分析:Grad与肾皮质ICAM-1表达含量呈负相关性(相关系数r=-0.923,P<0.01),AT、TTP与肾皮质ICAM-1表达含量呈正相关性(相关系数r分别为r=0.697,r=0.892,P<0.01),A、Area,值与ICAM-1表达含量无相关性(相关系数分别为r=0.108,r=0.295,P>0.05)。 结论:(1)超声造影技术较常规超声检查更敏感反映兔肾缺血再灌注损伤前后肾皮质微小动脉的血流灌注状态；(2)TIC曲线可以动态反映血液中造影剂浓度随时间的变化,获得的定量参数为微泡的充填速度和平衡后的微泡声强度,即准确反映红细胞在微血管的流动速度和组织的血流容积；(3)兔肾缺血再灌注损伤发生后的三天内有大量的中性粒细胞粘附于血管内皮细胞及组织间隙,产生严重的炎症反应,同时产生大量的坏死物质阻寒血管管腔,肾组织受到最严重的损伤。渡过该“危险期”,肾功能可以部分或是完全恢复。进一步阐述了中性粒细胞介导的缺血再灌注损伤的机制。(4)TIC曲线的各个参数和肾组织ICAM-1表达含量间存在的相关性表明超声造影检测技术不仅定量评价了肾脏血流灌注状态,而且还无创反映了肾组织炎症反应程度和范围；(5)超声造影检查是种非侵入性、安全可靠的检查方法,可以定量评估肾脏局部和整体的血流量,有望成为一种简便、无创、敏感地反脓肾缺血再灌注损伤肾炎症反应的检测方法。为临床上早期发现、早期诊断肾缺血再灌注损伤的相关疾病及其预后判断和疗效评价提供了新方法和新思路。
展开▼
