DMSO诱导HL-60为类中性粒细胞相关的生物学指标分析研究

摘要

目的:中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)是参与机体固有性免疫的主要细胞,它来源于骨髓干细胞,是生命期限极短的终末分化细胞,一旦释放入血便很快启动自发性凋亡(spontaneousapoptosis),这也是是中性粒细胞的内在生命本质特征。也正因此很难采用基因工程手段直接对中性粒细胞进行基因功能研究,这就为非凋亡非坏死性死亡机理研究带来了一定困难。急性髓细胞性白血病细胞系(HL-60)为我们的研究带来了新的思路。HL-60具有很强的诱导分化能力,在二甲亚砜(dimethyl sulfo-xide,DMSO)作用下,它可分化为成熟的髓样细胞,即类中性粒细胞(neutrophil-like cells)。类中性粒细胞具有很多中性粒细胞的分子标志物并具有中性粒细胞的潜在功能(1-3)。有研究对类中性粒细胞与中性粒细胞在细胞形态、化学激活和趋化性等方面进行了详细比较,发现二者表现出惊人的一致(4)。目前,类中性粒细胞已经成为广泛使用的中性粒细胞研究替代模型,且可以方便地使用基因工程手段进行基因功能研究(5)。我们的实验通过DMSO诱导HL-60细胞为类中性粒细胞,从细胞形态、细胞生物学活性、细胞凋亡相关蛋白等方面进行了探索性的研究,为进一步研究中性粒细胞自发性凋亡的机理提供模型。
　　 方法:体外培养HL-60细胞,在对数生长期细胞加入DMSO(终浓度1％)对其进行刺激和诱导,然后分别于24h、48h、72h、6d收集细胞,以未加DMSO处理的相应各时间点HL-60细胞作为空白对照组；运用光学显微镜镜下观察细胞的形态学变化； MTT法检测细胞活力；用Trizol法提取各组别细胞的总核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)；将RNA逆转录为互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)以上述cDNA为模板,分别扩增分化标志物CD11b及GAPDH内参片段；将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳；利用免疫印迹(westernblotting)技术检测凋亡相关蛋白Fas和Caspse3在类中性粒细胞中的表达。
　　 结果:(1)随着诱导时间的延长被诱导细胞的体积逐渐增大,48h后出现了肾形核、分叶核、蚕豆核等粒细胞核型,并随时间的延长逐渐增多。(2)DMSO处理后,24h开始,PCR结果显示CD11b的表达上调,与空白对照组相比有明显的差异性(P<0.01)(3)PCR结果显示空白细胞组,在0h、24h、48h亦隐约可见有CD11b的表达,72h、6d未见CD11b的表达。(4)western blotting显示DMSO处理前后,细胞中Fas、Caspase-3的表达量方面未见明显的规律变化。(5)western blotting显示DMSO诱导HL60细胞分化为中性粒细胞后,Fas、Caspase-3的Western-blot条带有变化。(6)western blotting显示对比对照组和DMSO处理组,比较明显的一个现象是,无论是Caspase-3还是Fas,在DMSO处理后,都出现了新的条带。
　　 结论:1.DMSO可以诱导HL-60细胞分化为类中性粒细胞。2.诱导成的类中性粒细胞表现出粒细胞核型。3.Fas和Caspase-3不能促进或延迟类中性粒细胞的凋亡。4.DMSO诱导HL60细胞分化为类中性粒细胞后,Fas、Caspase-3的表达显示可能有新的亚基出现。

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Fas/FasL介导中性粒细胞凋亡的研究进展(综述)

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