蜕皮甾酮对实验性肥胖模型细胞(胰岛素抵抗细胞模型)TLR4信号转导途径的影响

摘要

目的:通过培养、诱导、分化小鼠的3T3-L1前脂肪细胞,为实验细胞,使用游离脂肪酸(本实验使用软脂酸 PA)培养其建立胰岛素抵抗模型,使用蜕皮甾酮(ecdysterone,EDS)对3T3-L1脂肪细胞的增殖进行干预,探究EDS在体外对细胞胰岛素抵抗的影响及可能的分子作用机制,即能否通过抑制核因子ΚB( NF-ΚB)炎性路径上IKKβ蛋白与NF-ΚB蛋白的表达改善的胰岛素抵抗,能否通过下调跨膜受体TLR4的基因表达来减轻脂肪炎症。
　　方法:将小鼠3T3-L1前脂肪细胞常规培养于高糖 DMEM培养液中,2天换液一次,当细胞融合至75％左右时,用含10μg/ml胰岛素、1μmol/L地塞米松、0.5mol/L1-甲基-3异丁基-黄嘌呤(IBMX)的高糖DMEM培养液培养2天,然后换上含10mg/L胰岛素的完全培养液再培养6-8天,每2天换液一次;最后以完全培养基继续培养,共诱导分化12-14天,成3T3-L1脂肪细胞;将诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞换上含2g/L BSA(牛血清白蛋白)的高糖 DMEM培养液培养12h后,换上含0.5mol/L软脂酸(PA)、10g/L FAF BSA的DMEM培养24h,建成胰岛素抵抗模型。在培养液中加入各浓度蜕皮甾酮及浓度为1×10-5mol/L的吡格列酮同时孵育24小时。用MTT法检测蜕皮甾酮对3T3-L1脂肪细胞增殖的影响,用葡萄糖检测试剂盒检测各组细胞24小时培养液中葡萄糖的消耗量(氧化酶法),用Western印迹法检测各组IKKβ蛋白与NF-ΚB蛋白表达水平,用RT-PCR检测TLR4受体m RNA基因表达水平。实验共分为六组:(1)空白对照组:3T3-L1脂肪细胞;(2)模型组:肥胖细胞,即具有胰岛素抵抗的脂肪细胞;(3)蜕皮甾酮组:分组为蜕皮甾酮1×10-7组、蜕皮甾酮1×10-6组、蜕皮甾酮1×10-5组;(4)吡格列酮组,浓度为1×10-5mol/L。
　　结果:蜕皮甾酮浓度>1×10-4mol/L时,OD值显著降低(P<0.01),抑制了细胞生长;蜕皮甾酮浓度在1×10-7～1×10-5mol/L时,细胞生长率为92.70％～101.76％,生长良好;与模型组相比较,蜕皮甾酮在1×10-7～1×10-5mol/L浓度范围时,可使肥胖细胞的葡萄糖消耗量增加;胰岛素抵抗细胞中IKKβ蛋白与NF-ΚB蛋白的表达显著增加,TLR4受体m RNA基因的表达亦显著增加,经1×10-7～1×10-5mol/L浓度的蜕皮甾酮干预后,各组IKKβ蛋白与NF-ΚB蛋白表达及TLR4受体m RNA基因表达有不同程度的下降。
　　结论:(1)游离脂肪酸使脂肪细胞处于炎症状态,激活TLR4信号转导通路,使脂肪细胞产生胰岛素抵抗;(2)蜕皮甾酮在浓度>1×10-4mol/L时对脂肪细胞有明显的细胞毒性作用,故本实验选取蜕皮甾酮浓度为1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L;(3)蜕皮甾酮可以增加肥胖细胞葡萄糖消耗量,可以抑制肥胖细胞炎症反应通路TLR4信号转导途径中IKKβ蛋白与NF-ΚB蛋白的表达,可以使肥胖细胞细胞膜TLR4受体m RNA的表达减少,提示蜕皮甾酮可以改善 FFA诱导的胰岛素抵抗,其分子机制可能与蜕皮甾酮抑制TLR4信号转导途径有关。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

材料与方法

1 实验细胞

2 主要实验试剂与材料

3 主要实验仪器

4 实验步骤

5 统计学处理

结 果

1 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化及肥胖细胞模型的建立

2 蜕皮甾酮浓度对3T3-L1脂肪细胞增殖的影响

3 蜕皮甾酮对3T3-L1细胞葡萄糖消耗量的影响

4 蜕皮甾酮对IKKβ、NF-κB蛋白表达的影响

5 real time PCR结果

讨 论

1 蜕皮甾酮对糖尿病的意义

2 肥胖模型的建立

3 TLR4信号转导通路与胰岛素抵抗的发生发展关系

4 蜕皮甾酮对肥胖细胞IKKβ蛋白与NF-ΚB蛋白表达的影响

5 蜕皮甾酮对肥胖细胞TLR4基因表达的影响

结 论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综 述

1 人类受体TLR4

2 炎症特别是脂肪炎症与TLR4信号转导

3 TLR4信号转导/脂肪炎症与胰岛素抵抗

参考文献