胸腺肽a1对白血病细胞吲哚胺2,3-加双氧酶蛋白表达及免疫调节作用的实验研究

摘要

本文主要从以下两部分展开论述：
　　第一部分 目的：探讨胸腺肽α1( thymosin alpha-1,Tα1)对IFN-γ诱导的白血病细胞吲哚胺2,3-加双氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)蛋白表达的影响及其机制。方法：1.细胞的培养:实验分为IFN-γ/Ta1抑制IDO表达及IFN-γ/Ta1下调IDO表达组,再对每组进行不同浓度及时间的处理。2.将获得的细胞裂解后再纯化蛋白,并检测细胞内所含有的总蛋白。3.Western Blot方式探查每一个组分蛋白含量的变化。4.ECL充分浸泡,荧光检测仪看结果。结果：1.未加入IFN-γ时,IDOmRNA图谱上可见微弱显示,IDO蛋白印迹在图谱上未见明显显示,IFN-γ诱导后,IDO蛋白印迹图谱上条带显示明显增强。2.IFN-γ诱导后,加入Ta1作用,IDO蛋白条带随着Ta1浓度的增强及和作用时间的增长明显减弱,其图谱所得像素值也可说明。3.当IFN-γ/Ta1同时作用于HL-60与K562细胞后,IDO蛋白条带同样随着Ta1浓度的增强及和作用时间的增长明显减弱,提示Ta1能够削弱干扰素对IDO的干扰效果,产生的数量有所减少。结论：1.一般情况下,IDO在HL-60及K562细胞中呈现低水平表达,而IDO作为一种免疫负调节因子,是可以约束色氨酸分解的特殊作用的酶剂,而色氨酸逐渐的减少会引发T细胞的繁殖的减弱和死亡的机率大幅增多,从而导致免疫耐受,因此提示IDO的表达可能与白血病的免疫耐受机制有紧密的关系。2.干扰素-γ能使细胞的IDO产生数量变得很多。干扰素影响后,IDO大幅增强,提示IFN-γ的运用可能会促进肿瘤细胞的免疫逃逸,从而导致肿瘤细胞的大量增长,但是IFN-γ是一种特殊的Th1因子,能对机体的功能产生很大的影响,尤其是在免疫方面,因此在IFN-γ在用于一些患者的诊疗时,应警惕其对免疫方面形成的刺激作用。3.胸腺肽 al可以很明显的降低IDO的含量。IFN-γ诱导后HL-60与K562细胞IDO蛋白表达增强,当Ta1作用后,IDO蛋白表达呈浓度依赖性和时间依赖性下调,提示Ta1可以下调细胞IDO产生的数目。4.Ta1阻碍了IDO的大量的产生。IFN-γ/Ta1同时作用于HL-60与K562细胞后,IDO蛋白表达减弱,提示Ta1能够削弱IFN-γ对IDO的诱导作用,使其表达降低。Ta1作为一种生物免疫的反应调节剂,对白血病细胞IDO蛋白产生的阻碍作用为疾病的免疫治疗创造了新的发展方向。
　　第二部分 胸腺肽al下调HL-60及k562细胞IDO对T细胞发育的影响。
　　目的：研究Ta1下调IDO+HL-60/K562细胞对T细胞的干扰影响和相关通路。方法：1.IFN-γ诱导HL-60及K562细胞:IFN-γ(1000IU/ml)诱导HL-60及K562细胞72小时。2.已经经过药物处理的肿瘤细胞和PBL的联合孵育:实验分为①Hγ/kγ-MlR-PHA组;②Hγ/kγ-MlR-PHA+Ta1组;③Hγ/kγ-MlR-PHA+1-MT组,分别对三组进行药物诱导72小时。3.最后运用MTT来验证Ta1对T细胞的生长是否有降低影响:与MTT联合处理5h后停止培养,再小心添进DMSO充分混合直至完全溶解。4.用酶联测试机器630纳米检测OD数字并分析数据。结果：1.PHA与恶性细胞形状及数量的增长都无大量作用。2.PHA能明显使 T细胞数量及形态改变。电镜下观察PHA干扰后所生成的的T细胞数量变得更多。3.实验结果:Hγ/kγ-MlR-PHA组较 Hγ/kγ-MlR-PHA+Ta1组与 Hγ/kγ-MlR-PHA+1-MT组对 T淋巴细胞的抑制作用更加明显,生长率降低,与阳性及阴性组(PHA+T、T)相比照,有意义(p<0.05)。结论：1.PHA与恶性细胞的混合对实验结果没有太大的干扰,表明PHA与白血病细胞的混合培养对实验结果无影响。2.PHA大幅使T细胞的数量变多,PHA处理后可见T细胞的数量大幅增多,体积增大,有较大集落形成,形成淋巴母细胞群。3.Ta1可以减少IDO对T细胞的数量的增长的阻碍影响。PHA处理后,T细胞的数目大幅的提高,加入恶性细胞后,T细胞数量的生长受到阻碍制,而分别加入 Ta1与1-MT后,T细胞抑制率降低,1-MT是IDO的特殊降解物质,能够激烈的和色氨酸争夺控制IDO的活性,使色氨酸的产生逐渐变得更少。而第一部分实验证实Ta1能够降低IDO的产生水平,使它的量减少。本实验中,Ta1与1-MT都可以对T细胞的生长降低产生纠正使其数量变多,因此提示Ta1通过渐弱IDO含量高低来减低对T细胞的生长阻碍的影响。

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中文摘要

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前言

第一部分Ta1下调IFN-γ处理的白血病细胞IDO水平

材料与方法

1.主要实验材料

3、实验器材：

4、实验方法：

结果

讨论

结论

第二部分Ta1下调IDO+细胞对T细胞繁殖的控制作用

材料与方法

1. 主要实验材料

2.实验器材：

4、实验方法：

5、统计分析

结果

1.1 PHA对HL-60/K562细胞生长的影响

1.2 PHA对T细胞数目多少的改变

1.3 Ta1在对T细胞生长受阻率的改变

讨论

结 论

全文总结

英汉缩略名词对照表（Abbreviation）

参考文献

胸腺肽α1对白血病细胞介导免疫耐受的影响及其分子机制的研究进展

1 白血病细胞引起的免疫躲避和它的分子原理

3 Tα1对引起细胞免疫躲避的物质IDO的含量变化的作用

4 展望

参考文献