微囊藻毒素LR对慢性心房颤动患者心房肌SK2通道功能的调节

摘要

目的:心房颤动(Atrial fibrillation，简称AF)是临床上最常见的心律失常，具有很高的发病率和死亡率。目前对AF发病机制的解释包括“折返”学说和“驱动伴颤动样传导”理论，以及在此基础上发展起来的“肺静脉波”学说和“AF致AF”理论。小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+channels，SK)在哺乳动物心脏中呈心房选择性表达，并在心肌动作电位复极末期起作用。目前研究表明小电导钙激活钾通道参与AF的发生和维持，但其具体作用及机制仍有争议。PP2A是SK2通道的组成部分，它对SK2的具有调节作用，但这种调节作用与SK2通道自身的活动状态有关。本实验通过全细胞膜片钳技术观察AF患者心房肌细胞SK2通道电流的改变以及PP2A对SK2通道的调控，为探讨AF发生机制与防治方法提供理论基础和实验依据。
　　方法:利用全细胞膜片钳技术研究心房肌SK2通道电流的改变及在PP1和PP2A抑制剂MC-LR影响下的变化:将19例接受体外循环手术患者分为两组:AF组9例（细胞n=13），SR组10例（细胞n=17）。将接受体外循环手术患者手术过程中所切除的右心耳组织保存于氧饱和的Cardioplegic液中，迅速返回实验室，将组织放入氧饱和的Cardioplegic液中剪为1mm3组织块后，进行两步酶液（蛋白酶与胶原酶）消化。选取贴壁好，折光性强，立体感好，表面光滑的心房肌细胞进行实验。将细胞置于浴液中，采用全细胞膜片钳技术记录电流，阶跃方波脉冲方案:保持电位(holding potential，HP):-55mV，从-130mV以10mV阶跃去极至+50mV，脉冲时程200ms。电流信号通过膜片钳放大器(Axopatch 200B)放大并由滤波器处理后(1KHz)输入计算机，经Clampex 10.1软件采集数据，用Clampfit 10.1软件系统分析数据。实验观察和比较PP1和PP2A特异性阻断剂微囊藻毒素LR(Microcystin-LR，MC-LR)和CK2特异性阻断剂四溴苯三唑(TBB)对SK2通道的影响。
　　结果:
　　(1)急性酶分离的心房肌细胞SK2通道电流基本特性:
　　①全细胞膜片记录模式，在-130mV-+50mV之间记录到心房肌细胞混合电流呈现出明显的内向整流特征。
　　②在-130mV钳制电压下，SR组与AF组内向整流混合电流密度分别为-9.01±1.69pA/pF、-14.95±5.78pA/pF(nSR=8，nAF=6，P＜0.05)，AF组内向整流混合电流密度明显大于SR组。
　　③加入SK2通道特异性阻断剂Apamin(1×10-7mol/L)，内向整流混合电流明显减小，20min左右电流稳定不变。加药前后电流值相减得到SK2电流，AF组SK2电流密度大于SR组，在-130mV时SR组与AF组SK2通道电流分别为-2.66±0.32pA/pF、-6.37±0.20PA/pF(nSR=4，nAF=4，p＜0.05);SK2通道电流I-V曲线显示该电流具有内向整流特征，AF组SK2通道电流密度明显大于SR组。
　　(2)蛋白磷酸酶对人心房肌细胞SK2作用:
　　①全细胞膜片记录模式，细胞经MC-LR处理15min后，SR组可被apamin阻断的电流占混合电流的8.43±0.72％(-130mV，n=3)，未经MC-LR预处理电流抑制20.68±1.95％(-130mV，n=4)。两组Apamin对电流的抑制作用有明显差异。
　　②同样的方法观察MC-LR作用后AF组SK2通道电流。经MC-LR预处理后AF组心房肌细胞SK2通道电流密度减小，AF组可被Apamin阻断的电流占混合电流的20.95±11.36％(-130mV，n=5)，未经MC-LR预处理电流抑制40.26±1.24％(-130mV，n=3,P＜0.05)，Apamin对这两组电流的抑制作用有明显差异。
　　③MC-LR使SR组和AF组SK2通道电流在混合电流中比例下降，抑制比分别为8.43±0.72％、20.95±11.36％(nSR=3，nAF=5，P＜0.05)。
　　(3)CK2对内向整流混合电流的影响:全细胞膜片记录模式，浴液中加入CK2特异性阻断剂TBB（10μmol/L、20μmol/L），随时间延长内向混合电流大小无变化。
　　结论:
　　1.人心房肌细胞上有SK2通道电流，AF组SK2通道电流较SR组明显增加，提示SK2通道参与AF的心房电重构的过程;
　　2.MC-LR可以使SK2通道电流减小，且对AF组的抑制比例大于SR组，这与AF组SK2通道电流所占比例增加有关;
　　3.蛋白激酶CK2参与SK2通道的调节，但CK2抑制剂对心房肌细胞内向整流混合电流大小无影响;

目录

摘要

前言

材料与方法

1 研究对象

2 主要实验仪器

3 主要实验试剂

4 实验溶液配制

5 主要实验方法

结果

1 SR组与AF组内向整流混合电流的差异

2 SR组与AF组人心房肌SK2通道电流密度的比较

3 PP2A对人心房肌细胞SK2作用

4．CK2对人心房肌细胞SK2作用

讨论

1 SK2通道的基本特性

2 SK2通道与AF的关系

3 MC-LR对SK2通道的影响

4 蛋白激酶CK2与AF的关系

5 展望

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

小电导钙激活钾通道与房颤关系的研究进展 综述

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