血管内皮祖细胞移植对大鼠急性胰腺炎胰腺微循环改善作用的实验研究

摘要

目的：本实验通过检测血管内皮祖细胞( Endothelial progenitor cells , EPCs )移植到牛磺胆酸钠诱导的大鼠急性胰腺炎模型的CD133、CD34 免疫组化表达和 HE 染色血管密度的变化,研究血管内皮细胞对大鼠急性胰腺炎微循环的改善作用。方法：1.细胞分离培养和鉴定：选取成年健康 SD 大鼠,取大鼠股骨、胫骨,PBS 液冲洗骨髓腔,收集全部骨髓细胞,制成单核细胞悬液,加入到淋巴细胞分离液中,用密度梯度离心法离心,取中间白膜层的有核细胞,离心洗涤三次。利用差速贴壁法,取培养 48h 后未贴壁细胞,用含 10%的胎牛血清、5ng/ml bFGF、20ng/ml VEGF 的 M199 培养液培养于 6孔板中。培养10d后,免疫组化法和荧光双染法鉴定细胞。待细胞增殖到移植所需的数量时,收集细胞,无血清培养基洗涤两次,用无血清培养基制成单细胞悬液,以备移植。2、大鼠急性胰腺炎模型的建立和EPCs的移植：将72只健康成年雄性大鼠随机分为正常对照组(A组,n=24),急性胰腺炎模型组(B 组,n=24),急性胰腺炎内皮祖细胞移植组(C组,n=24)。将SD大鼠用1%戊巴比妥钠0.6ml/100g腹腔注射,于胰腺被膜下注射1%牛磺胆酸钠1ml(正常对照组被膜下注射同等量生理盐水),同时行空肠造瘘,术后均给予肠外营养。C 组通过大鼠颈外静脉置管注射经体外培养的内皮祖细胞。各组于C组移植后第3d、7d、14d三个时间点各取6只大鼠处死并收集胰腺标本甲 醛固定,胰腺组织HE染色后光镜病理学检查,观察胰腺病理形态变化,记录血管密度情况；免疫组织化学法(SP 法)检测胰腺组织中CD133、CD34的累积光密度值(IOD值)。以上所收集的数据采用均数±标准差( x ±s)表示,采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理；样本均数的比较采用单因素方差分析；两者的相关性采用直线相关和直线回归分析,P<0.05,则差异有统计学意义。结果：(1)B组(模型组)和C组(移植组)的病理评分在3d、7d、14d各时间点高于A (对照组)组(P<0.05)。B组的病理评分在7d、14d点高于C组(P<0.05)。(2)C组胰腺组织HE染色随机选取镜下微血管数在7d、14d高于A组(P<0.05),C组微血管数7d、14d高于B组(P<0.05)。(3)C组胰腺组织CD133的IOD值在各时间点均高于A、B组(P<0.05)。(4)C组胰腺组织CD34的IOD值在各时间点均高于A、B组(P<0.05)。(5)胰腺组织病理评分与CD133的IOD值呈直线相关(r=0.814,P=0.000)。结论：(1)通过密度梯度离心结合差速贴壁法能够从大鼠骨髓分离并培养得到的EPCs可以用于细胞移植。(2)培养的血管内皮祖细胞可通过成功移植到急性胰腺炎的大鼠胰腺组织中。(3)移植的内皮祖细胞能增加急性胰腺炎胰腺微血管的生成,从而使胰腺微循环障碍得到改善。

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封面

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中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

4 统计学处理

结果

1 EPCs的细胞形态

2 EPCs的鉴定结果

3 病理结果

3 胰腺组织中CD133和CD34免疫组化结果

5 相关性分析

讨论

1.大鼠骨髓EPCs体外培养方法的评价

2.大鼠急性胰腺炎模型的建立和评价

3.急性胰腺炎微循环障碍与血管内皮祖细胞的关系

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

血管内皮祖细胞研究进展

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