TWIST表观遗传抑制雌激素受体α表达的分子机制及乳腺癌临床意义

摘要

目的:探讨与肿瘤转移相关的重要转录因子TWIST与雌激素受体α(ERα)之间分子水平和功能上的调控关系及乳腺癌临床意义。
　　方法:首先,构建了pcDNA5-TWIST稳定表达细胞系;其次,为了鉴定出人类基因组中潜在的TWIST结合位点,我们用HEK293-TWIST细胞系和阴性对照的HEK293细胞系来进行ChIP测序分析;然后,为了检验表达HEK293-TWIST的细胞中NuRD复合物的各组分是否也被募集到ESR1基因上的TWIST结合部位,我们相继作了ChIP和ChIP-re-ChIP实验分析;再次,为了确定乳腺癌细胞系中TWIST与ERα的表达关系,我们通过RT-PCR和Westernblot方法,分析检测了5个不同类型的乳腺癌细胞系中ESR1(ERα基因)的mRNA和蛋白质水平;还有,为了检测ESR1基因上与TWIST/NuRD的相关区域是否具有抑制ESR1基因转录的功能,我们完成了如下实验:1、我们完成了荧光素报告基因分析技术;2、为了检测外源性TWIST的表达是否抑制内源性ERα的表达,我们在乳腺癌细胞中做了TWIST的RNA干扰技术和细胞转染过表达技术,使TWIST基因沉默和过表达进行分析;最后,为了检测人类乳腺癌患者中TWIST与ERα表达的关系及可能的临床意义,我们收集了28例乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤组织,抽提mRNA用半定量RT-PCR和用免疫组织化学方法检测了TWIST和ERα的mRNA和蛋白质水平。
　　结果:建立了HEK293-TWIST细胞系及其阴性对照的HEK293细胞系;应用该细胞系,进行ChIP测序分析,发现了一个位于人类ERα基因(ESR1)内含子7上的与TWIST结合的关键DNA区域;再通过ChIP-re-ChIP实验,揭示了HEK293-TWIST细胞系中的ESR1基因上的TWIST结合位点上与TWIST结合的NuRD复合物重要组分Mi-2,MTA2和HDAC2均结合到人类ERα基因(ESR1)内含子7上的关键DNA区域。这说明了TWIST可以有效地将NuRD复合物募集到ESR1基因上的TWIST结合区域;在高侵袭性的ERα表达阴性的SUM1315、MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞系中,用RT-PCR和Westernblot检测出高水平的TWISTmRNA和蛋白质表达,而在低侵袭性且高表达ERα的T47D和MCF-7细胞系中没有检测出TWIST的mRNA和蛋白质水平。在荧光素报告基因分析实验中,我们将TWIST结合的关键DNA区域克隆到pGL3-Pro-Luc报告基因上而构建成pGL3-332ESR1-Pro-Luc报告基因,再将pGL3-332ESR1-Pro-Luc报告基因质粒和TWIST表达载体共转染入HEK293细胞,结果发现过表达的TWIST显著地抑制了这个报告基因的活性,而对照组将pGL3-Pro-Luc和TWIST共转染的细胞中,TWIST的过表达并没有抑制对照组中pGL3-Pro-Luc这个报告基因的荧光素酶活性。显示ESR1基因上的TWIST/NuRD的相关区域具有转录抑制功能;在TWIST的RNA干扰和细胞转染过表达中,我们的分析揭示了在MDA-MB-435和4T1细胞系中使TWIST基因沉默,ERα的mRNA表达提高了2.5-3倍;在T47D细胞系中过表达TWIST,抑制了ERα的mRNA的表达;在MCF-7细胞系中过表达TWIST,降低了细胞中的ERα的蛋白表达水平,说明TWIST能抑制ERα的表达;HDAC抑制剂—TSA,或者基因沉默TWIST均能够解除TWIST的抑制作用。最后,我们收集28例侵袭性乳腺癌组织进行RT-PCR和免疫组化实验,发现有17位(61％)肿瘤患者具有TWIST的mRNA与蛋白高水平的表达而ERα的mRNA和蛋白低水平表达或无法检测到,7位(25%)肿瘤患者具有TWIST的mRNA和蛋白质低水平表达或者无法检测到而ERα的mRNA和蛋白质呈现高水平表达,2位(7%)肿瘤患者中TWIST和ERα的mRNA,蛋白质水平都增高,另2位(7%)肿瘤患者TWIST和ERα的mRNA,蛋白质水平都降低。这些结果显示在86%的侵袭性乳腺癌中,TWIST的表达与ERα表达呈负相关。
　　结论:揭示了TWIST表观遗传学抑制ERα表达的分子机制;在TWIST表达阳性的乳腺癌细胞中,TWIST通过招募NuRD复合物,从而抑制了ERα的表达;TWIST表达与ERα的蛋白表达呈负相关;ERα在乳腺癌细胞中的表达和抑制是一个可逆的过程。在这些ERα表达被抑制的乳腺癌细胞中我们使用HDAC抑制剂—TSA,或者基因沉默TWIST而重新恢复ERα表达,可望在临床上治疗乳腺癌患者时,可能恢复乳腺癌细胞对激素治疗的敏感性,因而TWIST有望成为乳腺癌治疗的新靶标新策略。

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英文摘要

前言

实验材料和方法

1 实验材料与试剂

2 主要实验仪器

3.实验方法

结果

1可诱导稳定表达pcDNA5/FRT/TO-TWIST细胞系的构建

2 ChIP-高通量测序鉴定分析

3 ChIP和ChIP-re-ChIP发现NuRD复合物也被招募到人类ESR1基因上

3 在5个细胞系中TWIST与ERα的表达关系

4 荧光素报告基因分析证明该ESR1基因内TWIST结合区DNA片段具有抑制活性

5 TWIST的过表达能下调ERα而RNA干扰能上调ERα表达

5 人类乳腺癌中TWIST表达与ERα表达呈负相关

讨论

1 雌激素受体α（ERα）表达与乳腺癌治疗意义

2 TWIST与ERα的表达调控关系及激素治疗敏感性探讨

3 TWIST/NuRD复合物对ERα表达的表观遗传抑制

结论

参考文献

英汉缩略名词对照表

TWIST促进恶性肿瘤转移关系的研究进展

附彩版图(1)

附彩版图(2)