大鼠毛囊干细胞的鉴定及选择其最适培养液的研究

摘要

目的：对所培养的毛囊干细胞进行鉴定，并比较3种不同培养基对于大鼠毛囊干细胞增殖情况的影响。
　　方法：取洁净SD大鼠乳鼠触须部组织，联合使用显微分离技术+中性蛋白酶II消化+胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液消化法获得细胞悬液，使用Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞。通过倒置显微镜下观察细胞形态特征，吉姆萨染色、流式细胞仪CD34、β1-整合素（CD29）及CK15检测，成骨诱导后茜素红染色、成脂诱导后油红O检测联合用于鉴定所获得细胞为具有多向分化能力的毛囊干细胞。之后取显微分离法+二部酶消化法所得细胞悬液计数后按细胞量平均分为3组，分别使用DMEM/F12培养+体积分数10％胎牛血清、角质细胞无血清培养基以及角质细胞无血清培养基+体积分数10%胎牛血清分三组进行培养，从细胞活率、生长曲线、流式细胞仪鉴定标记物几个方面对三组培养后的干细胞进行比较，从而间接判断三种不同培养基对于毛囊干细胞增殖所产生的影响。
　　结果：大鼠毛囊干细胞生长状况良好，CK15、CD34、β1-整合素（CD29）表达阳性，成骨诱导后茜素红染色阳性、成脂诱导后油红O阳性，此3组间细胞活率差异无显著性意义（P>0.05）。生长曲线显示：生长速度角质细胞无血清培养基+体积分数10%胎牛血清>DMEM/F12培养+体积分数10%胎牛血清>角质细胞无血清培养基（P<0.05）。DMEM/F12+10%胎牛血清组中CK15、CD34、β1-整合素（CD29）表达均低于其他2组（P<0.05），角质细胞无血清培养基组CD34的表达高于角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组（P<0.05），β1-整合素（CD29）及CK15则无统计学差异。
　　结论：使用上述方法培养的大鼠毛囊干细胞生长状况良好，具有毛囊干细胞表面标志物，并具有多向分化能力。角质细胞无血清培养基较DMEM/F12+10%胎牛血清能培养出纯度更高的毛囊干细胞，且在此培养基基础上加入胎牛血清，能够促进细胞的增殖。

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前言

研究内容与方法

1 试验材料

1.1 试验动物

1.2 主要试剂

1.3 仪器设备

1.4试验过程中所用实验器械

1.5 溶液配制

2 毛囊干细胞的培养及鉴定

2.1 试验前准备

2.2 毛囊干细胞的分离、培养

2.3 毛囊干细胞的鉴定

3 不同培养基对大鼠毛囊干细胞增殖的影响

3.1 大鼠毛囊干细胞的分组

3.2 不同培养方式下大鼠毛囊干细胞形态学观察

3.3 不同培养方式下大鼠毛囊干细胞存活率测试

3.4 CCK-8比色法分析不同培养方式对大鼠毛囊干细胞增殖活性影响

3.5不同培养方式下流式细胞仪结果比较

4 统计学分析

5 技术路线图

结果

1 毛囊干细胞的形态学观察及鉴定

1.1 毛囊干细胞的原代培养

1.2 毛囊干细胞的传代培养

1.3吉姆萨染色

1.4 流式细胞仪检测结果

1.5 成骨及成脂诱导及鉴定

2 角质细胞无血清培养基对于大鼠毛囊干细胞生长的影响

2.1 体外培养的HFSCs形态比较

2.2 体外培养的HFSCs存活情况

2.3 各组HFSCs增殖能力的测定结果

2.4 各组培养基培养下HFSCsCCK-8吸光度A值（λ=450nm）比较

2.5 流式细胞仪检测三组HFSCs培养结果

讨论

1.毛囊干细胞的生物学特性与培养

2.毛囊干细胞的鉴定

3.K-SFM培养基及血清在对于毛囊干细胞增殖影响的探讨

4.总结与展望

小结

致谢

参考文献

综述

攻读硕士期间发表的论文

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