新疆准噶尔乌头亲缘关系、炮制毒效活性及化学成分研究

摘要

目的:准噶尔乌头为毛茛科植物准噶尔乌头(Aconitum soongaricum Stapf.)的干燥块根，分布于我国新疆北疆地区，块根入药。准噶尔乌头是有毒药用植物，也是近年危害新疆草场的主要毒害草，如能利用，则可变毒为宝。因此拟研究准噶尔乌头是否与《中国药典》收载的乌头类药材，如川乌、草乌具有一定亲缘关系，是否具有与乌头类药材相类似的镇痛、抗炎、调节免疫等药用价值，是否可通过炮制降低毒性，在明晰其药用价值的前提下，进行生物碱单体成分的提取、分离和毒效活性研究，为使准噶尔乌头成为川乌或草乌的替代药材，为建立其法定药材质量标准奠定基础。
　　方法:1、采用RAPD和ISSR分子标记技术，分析准噶尔乌头与川乌、草乌之间的DNA分子亲缘关系;2、采用HPLC色谱分析方法，结合相似度分析、聚类分析、主成分分析研究准噶尔乌头与川乌、草乌之间的化学亲缘关系;3、(1)采用乌头类药材常用的3种炮制方法加工准噶尔乌头，通过HPLC法比较准噶尔乌头炮制前后生物碱化学成分的变化;(2)采用急性毒性、动物体内镇痛、抗炎、免疫调节等实验比较准噶尔乌头炮制前后药理作用的变化情况;(3)采用秩相关统计方法分析炮制前后化学成分与药理作用的相关性，结合准噶尔乌头炮制品毒效活性，确定准噶尔乌头炮制减毒方法;4、(1)采用溶剂提取分离方法，分离并鉴定准噶尔乌头生物碱单体成分;(2)采用细胞体外培养技术考察准噶尔乌头生物碱单体对大鼠心肌细胞毒性。
　　结果:1、从120条随机引物中筛选出15条RAPD引物，从100条随机引物中筛选出15条ISSR引物分别用于15个样本分析，在RAPD和ISSR分析下，不同种乌头间的平均遗传分化系数(GST)分别为0.4358和0.5005，不同种乌头群体之间的遗传分化差异较大，这表明基因流动较少(Nm)，基因流的估计值(Nm=0.6473和0.4991)也显示显著的分化;通过聚类分析，将15个乌头样本聚为3类，第1类:草乌和准噶尔乌头;第2类:川乌;第3类:白喉乌头，结果表明准噶尔乌头和草乌有较近的DNA分子亲缘关系;2、建立了准噶尔乌头生物碱成分HPLC指纹图谱，提取准噶尔乌头5个特征峰，分别是1苯甲酰乌头原碱，2苯甲酰次乌头原碱，3未命名化合物-2，4乌头碱，5未命名化合物-4;相似度分析、聚类分析、主成分分析结果表明准噶尔乌头与草乌有较近的化学亲缘关系;3、(1)准噶尔乌头炮制后双酯型乌头碱（乌头碱）含量降低，单酯型乌头碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱）含量增加，表明准噶尔乌头炮制减毒机制是其生品所含的双酯型乌头碱大多水解为毒性较低的单酯型乌头碱;(2)急性毒性实验结果初步表明准噶尔乌头炮制后急性毒性降低，炮制品具有镇痛、抗炎药理作用，可双向调节免疫功能，具有治疗风湿类疾病的药用价值;(3)秩相关分析结果表明，准噶尔乌头生品和炮制品中生物碱含量与抗炎药效指标相关度较高，呈一定剂量依赖关系，加热水煮法炮制品在急性毒性、药理活性方面均优于其他2种炮制品，加热水煮法炮制品的起效剂量为3.82g/人/日，与《中国药典》收载的制草乌人用临床剂量相似;加热水煮法炮制品双酯型乌头碱与单酯型乌头碱的含量符合《中国药典》收载的制草乌含量限度规定，优选“加热水煮法”作为准噶尔乌头炮制减毒方法;4、(1)提取分离并鉴定出5个单体化合物，分别为乌头碱(1)、准噶尔乌头碱(2)、12-表-欧乌碱(3)、16，17-二氢-12β，16β-环氧欧乌头碱(4)、脱氧乌头碱(5)，其中乌头碱和脱氧乌头碱为C19乌头碱型二萜生物碱，为准噶尔乌头的主要镇痛、抗炎活性成分，但同时也是其主要毒性成分;准噶尔乌头碱、12-表-欧乌碱、16，17-二氢-12β，16β-环氧欧乌头碱均为C20二萜生物碱napeline型;(2)12-表-欧乌碱和准噶尔乌头碱均有一定的心肌细胞毒性，其IC50分别为766.11μg/mL和726.80μg/mL，均低于乌头碱（IC50为562.06μg/mL）。
　　结论:1、首次研究了准噶尔乌头与已有法定药材标准乌头类药材的亲缘关系，表明准噶尔乌头与草乌具有较近的DNA分子和化学亲缘关系，为准噶尔乌头成为替代草乌的新药用资源提供了科学依据;2、准噶尔乌头具有乌头类药材的镇痛、抗炎药理活性，并可通过加热水煮炮制方法降低毒性，在治疗新疆常见多发的风湿类疾病方面有独特优势，具有较好的药用价值;3、分离并鉴定出准噶尔乌头5个生物碱单体成分，为建立其法定药材标准奠定了基础;4、准噶尔乌头炮制品的亚急性毒性、长期毒性，以及其生物碱单体在炮制水解过程中的变化途径、水解产物的毒效活性仍有待进一步深入研究。

目录

声明

中英文缩略词对照表

摘要

前言

第一部分基于RAPD及ISSR分子标记技术的准噶尔乌头亲缘关系研究

1 研究内容与方法

1．1 研究对象

1．2 内容与方法

1．3 质量控制

1．4 统计方法

1．5 技术路线图

2 结果

2．1 基因组DNA质检

2．2 RAPD和ISSR引物筛选结果

2．3 RAPD和ISSR分析结果

2．4 RAPD和ISSR聚类分析

2．5 种群遗传多样性和遗传分化分析

3 讨论

4 小结

第二部分 基于HPLC指纹图谱的准噶尔乌头亲缘关系研究

1 研究内容与方法

1．1 研究对象

1．2 内容与方法

1．3 技术路线图

2 结果

2．1 正交实验优化供试品前处理方法

2．2 确定色谱条件

2．3 HPLC指纹图谱的建立

2．4 基于HPLC指纹图谱的亲缘性研究

3 讨论

4 小结

第三部分 准噶尔乌头炮制及毒效活性研究

1 研究内容与方法

1．1 研究对象

1．2 内容与方法

1．3 统计方法

1．4 技术路线图

2 结果

2．1 生物碱的含量测定

2．2 急性毒性实验结果

2．3 镇痛作用实验结果

2．4 对AA大鼠抗炎作用的实验结果

2．5 对CIA大鼠抗炎作用实验结果

2．6 对免疫调节功能的影响

2．7 确定炮制方法

3 讨论

4 小结

第四部分 准噶尔乌头中生物碱提取分离及心肌细胞毒性研究

1 研究内容与方法

1．1 研究对象

1．2 内容与方法

1．3 统计方法

1．4 技术路线图

2 结果

2．1 生物碱的提取分离

2．2 结构鉴定

2．3 大鼠心肌细胞的毒性研究结果

3 讨论

4 小结

结论

致谢

参考文献

附录

综述 乌头属药用植物中生物碱资源及药理活性研究进展

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表