缺氧性肺动脉高压新生大鼠体内热休克蛋白70对HIF-1α的阻断作用研究

摘要

目的：
　　1、探讨腺病毒介导热休克蛋白70（HSP70）基因转染液的制备。
　　2、探讨腺病毒介导HSP70基因转染到新生大鼠肺组织内最佳转染途径、转染量和转染时间。
　　3、探讨通过基因转染技术，观察经HSP70基因转染后缺氧性肺动脉高压(HPH)新生大鼠的肺动脉压力、肺血管结构及重塑指标改变的情况，以及肺组织中HSP70、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及其下游靶基因内皮素-1（ET-1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达情况，了解HSP70对HPH新生大鼠肺动脉压力、肺血管重塑的作用，进一步推断HSP70能否通过下调HIF-1α及其下游靶基因的表达，进而延缓新生大鼠 HPH的发生发展，为临床防治该病提供理论依据。
　　方法：
　　1、通过pHBAd-MCMV-GFP-HSP70质粒的构建，利用双质粒共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒，进行毒种的鉴定、生产、纯化及滴度测定。
　　2、
　　（1）将48只新生大鼠随机分为A：尾静脉注射组，B：腹腔注射组，将5ul×1010 PFU/ml腺病毒HSP70（Ad-HSP70）转染液注入新生大鼠体内，分别在观察时间点将各组新生大鼠处死，留取肺组织标本，用荧光显微镜判断HSP70转染到新生大鼠肺组织的途径。
　　（2）将54只新生大鼠随机分为：空病毒组，病毒HSP70组，对照组，分别给予2.5ul×1010 PFU/ml、5ul×1010 PFU/ml、10ul×1010 PFU/ml的转染液剂量，经过尾静脉注射转染后72h将各组新生大鼠处死，留取肺组织标本，用RT-PCR及Western blot检测HSP70的mRNA及蛋白质水平，确定腺病毒介导的HSP70转染的最佳转染量。
　　（3）确定腺病毒介导HSP70转染的最佳途径、最佳转染量后，按照不同转染时间将48只新生大鼠随机分为24h组，48h组，72h组，96h组，同时设立盐水空白对照组，按照时间点处死新生大鼠，留取肺组织标本，采用RT-PCR及Western blot检测HSP70的mRNA及蛋白质水平，明确HSP70在新生大鼠肺组织内表达的最佳转染时间。
　　3、将128只新生大鼠随机分为2组：HPH组（H）和空白对照组（C）。H组：根据转染液不同再分为H1：盐水组、H2：空病毒组（pHBAd-MCMV-GFP）、H3：病毒HSP70组（pHBAd-MCMV-GFP-HSP70）。H组新生大鼠注射病毒转染液或无菌盐水后立即建立HPH模型，并分别于缺氧3d、7d、10d、14d和对照组同步进行观察。
　　（1）在不同观察时间点测定肺动脉压力（mPAP），比较各组mPAP的变化情况，了解腺病毒介导的HSP70是否有降低mPAP的作用。
　　（2）用光学显微镜、电子显微镜分别观察肺小动脉组织结构及肺血管超微结构变化，测定肺小血管重塑指标（MT％、MA%）。
　　（3）用免疫组化、RT-PCR和Western blot法分别检测不同时间点各组新生大鼠肺组织中HSP70、HIF-1α、ET-1、iNOS的mRNA及蛋白质的表达情况，比较四种因子在各组之间的差异，从而进一步推断腺病毒介导的HSP70阻断HIF-1α及其靶基因在新生大鼠HPH中的作用。
　　结果：
　　1、重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-HSP70序列测定与Genebank的登记序列一致，确定为HSP70基因。
　　2、
　　（1）尾静脉注射组新生大鼠48小时荧光显微镜下见少量绿色荧光信号标记蛋白，72及96小时见明显的绿色荧光信号标记蛋白。
　　（2）5ul×1010 PFU/ml Ad-HSP70转染剂量的新生大鼠肺组织内HSP70mRNA及蛋白质表达量增高。
　　（3）转染新生大鼠72h后，新生大鼠肺组织内HSP70mRNA及蛋白质表达量较24h、48h增高（P＜0.05），与96h比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　3、
　　（1）H1组与 H2组缺氧3d、7d、10d、14d的mPAP水平与对照组比较显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；H3组缺氧3d、7d、10d的mPAP水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），缺氧14d的mPAP水平与同日龄H1及H2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　（2）HE、VG染色光镜下观察H3组缺氧3d、7d、10d无肺血管重塑，14d肺血管重塑较轻；电镜下肺超微结构显示H3组缺氧7d、10d、14d肺血管重塑减轻；缺氧7d、10d各组间肺血管MA%、MT%比较差异有统计学意义（P＜0.05）， C组及H3组与H1、H2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；缺氧14d各组间肺血管MA%、MT%比较差异有统计学意义（P＜0.01），C组与HPH各组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　（3）免疫组化显示对照组肺组织中 HSP70、HIF-1α、ET-1及iNOS免疫反应强度呈阴性，HPH各组HSP70、HIF-1α、ET-1及iNOS免疫反应强度呈不同程度的阳性反应，其表达多见于肺血管壁内皮细胞质与细胞上；缺氧3d、7d、10d各组间HSP70免疫组化表达强度比较差异有统计学意义（P＜0.05），HPH各组与C组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.01），H3组与H1、H2组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.01）；缺氧3d、7d、10d各组间HIF-1α、ET-1及iNOS的免疫组化表达强度比较差异有统计学意义（P＜0.01），HPH各组均表达增强，H3与H1、H2组比较表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　（4）缺氧3d、7d、10dHSP70的mRNA表达各组间比较差异有统计学意义（P＜0.01），HPH各组与C组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.05），H3组与H1、H2组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.05），14d HPH组与C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；缺氧3d、7d、10d各组间HSP70蛋白质表达比较差异有统计学意义（P＜0.05），H1、H2组与C组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.01），H3组与H1、H2组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　（5）缺氧3d、7d、10dHIF-1αmRNA、ET-1mRNA、iNOSmRNA表达各组间比较差异有统计学意义（P＜0.01），H1、H2组与C组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.05），H3组与H1、H2组比较表达降低差异有统计学意义（P＜0.05）；各组间HIF-1α、ET-1、iNOS的蛋白质比较差异有统计学意义（P＜0.05），H3组与H1、H2组比较表达降低差异有统计学意义（P＜0.05）。缺氧14d各组间iNOSmRNA表达比较差异有统计学意义（P＜0.05），HPH各组与C组比较表达增强差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论：
　　1、成功构建了HSP70基因重组腺病毒载体及制备高滴度的重组腺病毒。
　　2、确定腺病毒介导的HSP70在新生大鼠体内转染的最佳途径：尾静脉，转染量：5ul×1010PFU/ml及转染后最早观察时间点：72h。
　　3、缺氧应激可以引起内源性HSP70表达，腺病毒介导的HSP70可以提高HPH新生大鼠肺组织外源性HSP70的表达，下调HIF-1α、ET-1、iNOS的表达，降低肺动脉压力，减轻肺血管重塑，可以成为治疗新生儿HPH的一种新策略。

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中英文缩略词对照表

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 腺病毒介导HSP70基因载体的构建与鉴定

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 腺病毒介导的HSP70对新生大鼠体内HSP70表达水平的影响

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 腺病毒介导的HSP70对缺氧性肺动脉高压新生大鼠体内HIF-1α的阻断作用研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

本研究创新点

本研究不足之处

展望

致谢

参考文献

附录

综述: 缺氧诱导因子-1α与热休克蛋白70在新生儿缺氧性肺动脉高压的作用研究

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表