晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKIs及铂类药物疗效预测因素探索分析及相关耐药机制研究

摘要

目的：（1）以全血细胞计数中炎症免疫指标为分析对象，探索应用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）治疗EGFR突变晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的疗效预测因素，筛选EGFR-TKIs的最大获益人群，指导EGFR-TKIs的临床应用及EGFR突变晚期非小细胞肺癌患者的精准医疗；（2）从基因组学水平系统分析与非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药相关的单核苷酸变异及小片段插入/缺失等基因突变，探索与EGFR-TKIs治疗疗效及预后相关的驱动基因突变及其下游靶标；（3）探讨驱动蛋白KIF4A在预测EGFR-TKIs获得性耐药后铂类药物疗效中的价值及其分子作用机制。 方法：（1）回顾性分析127例接受一线EGFR-TKIs靶向治疗的EGFR突变的IIIB期-IV期NSCLC患者的临床资料，采用受试者工作特征（ROC）曲线确定全血细胞计数中能够预测EGFR-TKIs疗效的炎症免疫指标的最佳临界值，并按最佳临界值分为高、低两组，并采用Kaplan-Meier生存分析两组患者的炎症免疫指标及其他临床病理因素与无进展生存期(progression-free survival，PFS）、总体生存期（overall survival，OS）关系，绘制生存曲线。使用多变量Cox比例风险回归模型进一步确定影响PFS和OS的独立预后因素。（2）收集14例接受EGFR-TKIs靶向治疗携带EGFR敏感突变的晚期NSCLC患者耐药后血浆标本，提取循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）进行二代靶向捕获测序，靶向测序基因包括TP53、EGFR、KRAS、ERBB2、PIK3CA等在内的143个肿瘤相关基因，结合生物信息学方法鉴定与EGFR-TKIs耐药及肿瘤免疫相关的肿瘤驱动基因的突变及其富集的信号通路情况。根据EGFR-TKIs靶向治疗无进展生存期的长短进行分组，分为PFS长组（PFS＞14个月，n=7）和PFS短组（PFS≤14个月，n=7），并对两组晚期非小细胞肺癌患者的突变基因进行对比分析。（3）通过免疫组化法检测的晚期NSCLC患者EGFR-TKIs获得性耐药后穿刺肺癌组织及正常组织中驱动蛋白家族成员4A（kinesin family member4A，KIF4A）的表达情况，分析其与铂类化疗药物疗效及预后关系。以人非小细胞肺腺癌细胞A549及其顺铂耐药细胞A549/DDP为研究模型，通过RT-PCR及Western Blot实验，检测对比A549细胞与A549/DDP细胞中染色体驱动蛋白KIF4A及肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP）的表达情况。应用细胞转染技术在A549细胞中过表达外源性KIF4A，通过MTT实验，检测不同浓度梯度顺铂对两株细胞生长增殖的影响。应用蛋白免疫共沉淀技术检测细胞内蛋白KIF4A与LRP相互作用结合情况。表达驱动蛋白KIF4A及LRP不同结构域，通过蛋白免疫共沉淀实验，鉴定驱动蛋白KIF4A与LRP蛋白相互作用的结构域。通过细胞免疫荧光染色观察KIF4A与LRP在细胞中的共定位情况。采用小分子干扰RNA（siRNA）敲降A549/DDP细胞内源性KIF4A，免疫荧光染色检测驱动蛋白KIF4A是否调控LRP的胞质分布，并通过RNAi rescue实验加以验证。 结果：（1）①通过受试者工作特征曲线及约登指数分析，淋巴细胞与单核细胞比值（Lymphocyte-to-monocyte ratio，LMR），中性粒细胞与淋巴细胞比值（Neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）最佳截断值（cutoff值）分别为3.37和2.90。全血细胞计数中WBC、HB、PLT、PLR、RDW、MPV等指标不适作对预后分析的潜在标志物（P＞0.05）。②非小细胞肺癌患者特征与LMR和NLR的相关性分析结果显示：患者的年龄，是否吸烟，病理组织类型，临床分期，ECOG评分，EGFR-TKIs药物种类和EGFR突变类型在LMR及NLR高低水平两组间无显著差异。中性粒细胞计数减少（P=0.002），淋巴细胞计数增加（P＜0.001），单核细胞减少（P＜0.001）与LMR高水平、NLR低水平显著相关。③ECOG评分（P＜0.001），LMR（P=0.007），NLR（P＜0.001）与患者的无进展生存期显著相关，是影响无进展生存期的危险因素。ECOG评分越低，高LMR，低NLR的患者无进展生存期明显延长。并且ECOG评分(HR1.909，95%CI：1.283-2.840，P=0.001)，NLR(HR1.049，95%CI：1.009-1.090，P=0.015)是影响患者EGFR-TKIs治疗PFS的独立预后因素。④ECOG评分（P=0.002），LMR（P=0.034），NLR（P＜0.001）与患者的OS显著相关，是影响OS的危险因素。ECOG评分越低，高LMR，低NLR的患者OS明显延长。ECOG评分(HR1.976，95%CI：1.209-3.232，P=0.007)，NLR(HR1.043，95%CI：0.997-1.092，P=0.038)是影响患者OS的独立预后因素。（2）①14例样本中一共检测到靶向捕获列表中的143个肿瘤相关基因上的2830个SNVs和925个Indels，在SNVs中，主要包括720个内含子区域的突变，1912个外显子区域的突变，外显子区域突变类型包括473个同义突变，1370个错义突变等。②PFS短组和PFS长组患者的血浆游离DNA浓度分别为2.731±5.544ng/μl和0.446±0.178ng/μl，两组之间差异有统计学意义（P=0.040）。且PFS短组非同义突变个数多于PFS长组。③14例靶向捕获测序样品中位于基因编码区的体细胞突变碱基替换类型以C>T的替换为主，其次为T>G的替换。④通过对高频突变基因进行KEGG通路富集分析发现MTOR，JAK1，AKT3，RAF1，FGFR3等25个基因是与EGFR-TKIs耐药密切相关的体细胞突变基因。⑤Kaplan-Meier生存分析显示CTNNB1、BRAF、CSF1R、PIK3CA基因野生型组中位PFS均长于基因突变组（P=0.040，P=0.024，P=0.005，P＜0.001）。（3）①EGFR-TKIs获得性耐药后非小细胞肺癌组织与正常肺组织中KIF4A蛋白表达阳性率分别为60.00%和26.67%，两组间差异有统计学意义（P=0.038）。KIF4A蛋白表达阳性与阴性患者EGFR-TKIs获得性耐药后接受铂类药物治疗的PFS分别6个月和9个月，两组间PFS差异有统计学意义（P=0.003），KIF4A蛋白表达阳性与阴性患者的OS分别16.5个月和22个月，两组间OS差异有统计学意义（P=0.007）。②KIF4A及LRP在A549/DDP细胞中mRNA及蛋白表达水平显著高于A549细胞。③过表达GFP-KIF4A的A549细胞对顺铂的敏感性明显低于过表达GFP的A549细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。④KIF4A尾部结构域（C230）或KIF4A杆状尾部结构域（C896）能与LRP结合，与KIF4A全长（FL）效果相同，而KIF4A的N-末端（N351和N1018）不能与LRP结合；KIF4A可以与LRP全长或LRP的N-端（N447）结合，而LRP的C-端（C446）不能与KIF4A结合。⑤KIF4A与LRP部分共定位于细胞质中的微管骨架上，在对照siRNA转染的细胞中，LRP分散于整个细胞质中，而在KIF4A表达抑制的细胞中LRP大量聚集在核周区。在KIF4A表达抑制的A549细胞中，LRP主要在核周区聚集。在表达GFP-KIFA-FL但缺乏内源性KIF4A的细胞中LRP在细胞质中正常分布。表达截短的KIF4A突变体N351，N1018，C896或C230但缺乏内源性KIF4A的细胞LRP聚集在细胞核周区。 结论：（1）炎症免疫指标NLR和LMR是反映EGFR突变晚期NSCLC患者EGFR-TKIs治疗疗效的重要生物标志物之一。治疗前高LMR和低NLR患者更容易从EGFR-TKIs治疗中受益，且低NLR是EGFR-TKIs治疗后晚期NSCLC患者长期PFS和OS的独立预后生物标志物。（2）①接受EGFR-TKIs靶向治疗的NSCLC患者ctDNA浓度与基因的突变个数和突变频率与PFS显著相关。②携带CTNNB1、BRAF、CSF1R、PIK3CA基因突变可能提示NSCLC患者EGFR-TKIs靶向治疗疗效不佳。（3）①非小细胞肺癌组织中KIF4A蛋白表达显著高于正常组织。KIF4A表达阴性患者EGFR-TKIs获得性耐药后接受铂类化疗的PFS、OS显著长于KIF4A表达阳性患者。②驱动蛋白KIF4A通过与细胞质中的LRP结合，并转运LRP进而促进非小细胞肺癌铂类药物的耐药过程。③KIF4A的尾部结构域与LRP的N-末端相互作用，LRP在胞质中分布需要KIF4A的全长发挥作用，驱动蛋白KIF4A是LRP细胞质内转运载体之一。

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