猪瘟兔化弱毒疫苗株cDNA分子克隆与嵌合分子克隆的构建

摘要

猪瘟(classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起猪的一种高度接触性和致死性传染病，以发热和出血为主要特征，世界动物卫生组织将其列为A类16种法定传染病之一。猪瘟的流行给世界养猪业的发展和贸易造成了巨大损失。猪瘟兔化弱毒疫苗(hogcholeralapinizedvirus，HCLV)是我国自主研制成功的有效疫苗，在猪瘟的防制中发挥了巨大作用，但由于疫苗接种猪与自然感染猪不易从血清学上予以区分，不利于猪瘟的净化和消灭，研制标记疫苗有助于解决这个问题。 本研究旨在构建HCLV基因组全长cDNA克隆，以建立猪瘟病毒反向遗传操作平台。参照已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了覆盖全基因组的9对引物，经过RT-PCR、克隆、测序、拼接，获得了HCLV全基因组序列(GenBank登录号AY805221)。通过与另外7个国内外发表的HCLV基因组全序列比较分析发现，HCLV基因组在遗传学上是相当稳定的。将9个片段分成两个部分(F1、F2、F3、F4、F5和F6、F7、F8、F9)，运用多片段一步连接法，分别克隆到载体pOK12后，得到两个半长基因组cDNA克隆pOK12/Fl-5和pOK12/F6-9，再将其连接成全长基因组cDNA克隆pOK12/F1-9(pOKHCLV)。通过插入、替换、缺失等对pOKHCLV进行改造，获得了pOKHCLV/EGFP(插入EGFP基因)、pOKHCLV/EIAVep(插入马传染性贫血病毒抗原表位)、pOKHCLV/3'UTR(用石门强毒株的3’非编码区替换HCLV相应区域)、pOKHCLV/Shimen(用石门强毒株的3’半段替换HCLV的相应区域)、pOKShimen/HCLV(用石门强毒株5’半段替换HCLV的相应区域)、pOKHCLVdel4764(缺失HCLV编码区4764bp)、pOKCIHCLV(将HCLV基因组置于CMV启动子控制之下)等一系列猪瘟病毒嵌合分子克隆。这些分子克隆和嵌合分子克隆为研究HCLV致弱机制和标记疫苗奠定了基础。

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