乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2生物学特征的评价

摘要

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)也称乙脑，是一种严重的急性神经系统传染病，主要通过携带乙脑病毒的蚊媒叮咬传播，致死率可达30％，且后遗症严重。我国研制的乙脑减毒活疫苗自1989年上市至今已在很多乙脑流行的国家和地区广泛应用。用于乙脑减毒活疫苗生产的SA14-14-2，是由亲本野毒株SA14经过在细胞和动物中连续传代和多轮蚀斑纯化而获得的一株减毒株。然而，疫苗株毒力回复的可能性仍然存在，也是减毒活疫苗生产和应用中最为关注的问题。
　　为了探究疫苗株SA14-14-2在体内和体外的遗传和减毒特征稳定性，我们将其在Veto细胞和鼠脑中连续传代，进而比对基因序列和毒力特征评价。结果显示，疫苗株SA14-14-2通过Vero细胞的12次传代后，只有C蛋白第66位的Ser突变为Leu。此外，子代病毒仍能维持小斑特征;进一步的毒力评价实验的结果表明，子代病毒仍然具有明显的减毒特征。值得注意的是， SA14-14-2在鼠脑内经过连续传代后，基因组发生了一系列的适应性突变。这些突变均位于E蛋白，分别为E-107(F→L)、E-138(K→E)、E-226(T→R)和E-270(I→T)。毒力评价的结果也显示，传代病毒的神经毒力明显提高，神经侵袭力也有所增强。这表明，乙脑疫苗株SA14-14-2通过鼠脑传代所产生的适应性突变可能与小鼠的神经毒力和神经侵袭力的增强密切相关。本研究有助于乙脑减毒活疫苗的质量控制，同时也为帮助了解黄病毒疫苗的减毒机制提供理论依据。

目录

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论文说明

摘要

英文缩略词表

第1章 绪论

1．1 乙型脑炎的概述

1．1．1 历史分布及流行病学

1．1．2 传播途径

1．1．3 临床表现

1．2 乙型脑炎病毒的概述

1．2．1 病毒基因组结构及蛋白功能

1．2．2 病毒的分型及流行特征

1．2．3 乙型脑炎疫苗研究进展

1．3 研究的目的和意义

第2章 乙脑疫苗株在细胞和乳鼠颅内中的连续传代

2．1 材料

2．1．1 病毒株、细胞株、小鼠

2．1．2 试剂，仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞的冻存

2．2．2 细胞的复苏

2．2．3 疫苗株SA14-14-2的扩大培养

2．2．4 疫苗株SA14-14-2在Vero细胞中的连续传代

2．2．5 疫苗株SA14-14-2在乳鼠颅内增殖力的测定

2．2．6 疫苗株SA14-14-2在乳鼠颅内的连续传代

2．2．7 病毒滴度的测定

2．3 结果

2．3．1 疫苗株SA14-14-2在Vero细胞的连续传代

2．3．2 疫苗株SA14-14-2在乳鼠颅内的复制能力

2．3．3 疫苗株SA14-14-2在乳鼠颅内的连续传代

2．4 讨论

第3章 体外传代的疫苗株的遗传稳定性和毒力特征评价

3．1 材料

3．1．1 毒株、小鼠和细胞系

3．1．2 试剂与仪器

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 子代病毒RNA及cDNA的制备

3．2．3 病毒cDNA的分段PCR扩增及回收

3．2．4 分片段的序列测定和比对

3．2．5 空斑形态的比较

3．2．6 病毒对成鼠毒力的测定

3．3 结果

3．3．1 体外传代所得子代病毒基因组扩增分片段及产生突变位点的鉴定

3．3．2 体外传代所得子代病毒基因序列分析

3．3．3 疫苗株体外传代后子代病毒空斑形态的比较

3．3．4 疫苗株体外传代后毒力特征的评价

3．4 讨论

第4章 体内传代的疫苗株的遗传稳定性和毒力特征评价

4．1 材料

4．1．1 毒株、小鼠和细胞系

4．1．2 试剂与仪器

4．2 方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 子代病毒RNA及cDNA的制备

4．2．3 病毒cDNA的分段PCR扩增及回收

4．2．4 分片段的序列测定和比对

4．2．5 空斑纯化

4．2．6 空斑形态的比较

4．2．7 病毒对成鼠毒力的测定

4．2．8 突变率的计算

4．3 结果

4．3．1 体内传代所得子代病毒基因组扩增分片段及产生突变位点的鉴定

4．3．2 体内传代所得子代病毒基因序列分析

4．3．3 疫苗株体内传代后子代病毒空斑形态的比较

4．3．4 鼠脑传代所得子代病毒P4和P8单克隆空斑形态的比较

4．3．5 疫苗株体内传代后减毒特征的评价

4．4 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢