马疱疹病毒Ⅰ型gD基因真核重组质粒与原核表达蛋白联合免疫效果研究

摘要

马鼻肺炎（Equine rhinopneumonitis）被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病，是由马疱疹病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。马疱疹病毒包括马疱疹病毒Ⅰ型（Equine herpesvirusⅠ）和马疱疹病毒Ⅳ型(Equine herpesvirusⅣ)。EHV-Ⅳ主要感染上呼吸道。EHV-Ⅰ可影响多个器官系统，患畜表现为发热、食欲不振以及呼吸道等症状，有些可引起流产、新生马驹死亡、神经系统疾病等。虽然感染马鼻肺炎后死亡率不高，但是其引起的后遗症会给马匹带来巨大的健康隐患。
　　根据Genbank上公布的马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-Ⅰ) gD基因的序列分别设计一对特异性引物并进行扩增，获取的目的基因片段克隆到pMD19-T载体中，将测序鉴定正确的目的基因克隆到真核表达载体pVAX1上，PCR、酶切及DNA测序结果证实成功构建了含有马疱疹病毒Ⅰ型gD基因的真核表达载体pVAX1-gD。通过介导重组质粒转染BHK-21细胞，经Western blot证实基因可在BHK-21细胞中表达。随后将gD重组质粒与gD蛋白分别与混合肌肉注射免疫小鼠，检测一免、二免的小鼠血清中和抗体效价，以及二免后的小鼠淋巴细胞增殖情况。ELISA与MTT检测结果表明，联合免疫能有效的诱导特异性血清中和抗体的产生，同时显著促进了特异性淋巴细胞的增殖。
　　本研究成功构建了pVAX1-gD真核重组质粒，并且与pET-30a-gD蛋白联合免疫能诱导机体产生较高的体液免疫与细胞免疫，为马鼻肺炎基因工程疫苗的研制奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第1章 绪论

1．1 病毒的生物学特性

1．1．1 病毒的分型

1．1．2 病毒的形态和理化特性

1．2 病毒的基因组和主要糖蛋白功能

1．2．1 病毒的基因组

1．2．2 病毒的主要糖蛋白功能

1．3 马鼻肺炎的流行

1．4 病毒的致病机制与临床症状

1．5 诊断方法

1．5．1 病理组织观察

1．5．2 血清学检查

1．5．3 聚合酶链式反应

1．5．4 环介导等温扩增技术

1．5．5 病毒中和试验

1．6 疫苗

1．6．1 传统疫苗

1．6．2 新型疫苗

1．7 核酸疫苗的优缺点

1．7．1 核酸疫苗的优点

1．7．2 核酸疫苗的缺点

1．8 目的意义

第2章 EHV-I gD基因真核表达载体的构建及表达

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 引物的设计与合成

2．2．2 gD基因的PCR扩增

2．2．3 PCR产物的回收

2．2．4 连接与转化

2．2．5 重组质粒的提取

2．2．6 重组质粒的鉴定

2．2．7 真核表达载体pVAX1-gD的构建

2．2．8 无内毒素重组质粒pVAX1-gD的提取

2．2．9 重组质粒pVAX1-gD的细胞转染

2．2．10 Western-blot检测转染细胞中表达的gD蛋白

2．3 结果与分析

2．3．1 EHV-I gD基因PCR扩增结果

2．3．2 pMD19-T-gD重组质粒鉴定结果

2．3．3 pVAX1-gD重组质粒鉴定结果

2．2．4 Western blot分析结果

2．4 讨论

第3章 免疫效果的研究

3．1 材料

3．1．1 质粒及实验动物

3．1．2 主要试剂

3．1．3 仪器与材料

3．2 方法

3．2．1 免疫原的制备

3．2．2 实验动物的免疫方案

3．2．3 免疫小鼠血清抗体效价测定

3．2．4 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖的检测

3．3 结果

第4章 结论

参考文献

致谢

作者简历