塔吉克斯坦土壤可培养细菌、放线菌种群多样性及功能菌株筛选

摘要

塔吉克斯坦共和国为内陆高山国家，具有复杂的生态系统，拥有独特的生物多样性和众多珍贵的生物物种，具有重要的研究和开发利用价值。本研究采用纯培养法、16S rDNA PCR-RFLP分析、Rep-PCR及16S rDNA序列测定和系统发育分析方法、透明水解圈法、DNS法、Folin-酚试剂法及琼脂块法首次对塔国土壤中可培养细菌、放线菌群落结构和种群多样性进行分析，并筛选具有功能酶活性和拮抗活性的菌株。研究旨在明确塔国不同生态环境中微生物种群多样性和分布特点，丰富微生物物种资源库和基因库，同时也为土壤微生物新的资源挖掘和开发新的活性物质奠定科学基础。本研究取得主要研究结果如下:
　　1.从塔国哈特隆州的农田、天然草地、林地及荒漠土壤中分离获得110个细菌菌株，分布在厚壁菌门(Firmicutes)(80.9％)、变形杆菌门(Proteobacteria)(17.2％)和放线菌门（Actinobacteria）(1.85％)三个类群中，归属于芽孢杆菌（Bacillus）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas）、短杆菌（Brevibacterium）、节杆菌（Arthrobacter）、棍状杆菌（Clavibacter）、短波单胞菌（Brevundimonas）、贪食菌（Variovorax）、假单胞杆菌（Pseudomonas）、芽孢八叠球菌（Sporosarcina）、赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus）、无色杆菌属（Achromobacter）和Rheinheimera共12个属中。其Bacillus(71.8％)为绝对优势种群，所包括的63株分离物Rep-PCR基因呈现17种不同的多态性指纹图谱。土壤中可培养细菌的种群分布、结构组成及多样性存在明显差异，与土壤环境密切相关。Shannon多样性指数、Simpson优势度和Pielou均匀度指数与土壤有机质、全氮、碱解氮及含水量呈显著正相关(p＜0.05)。土壤速效钾含量也是显著影响细菌Shannon多样性、Simpson优势度的重要因素。
　　2.从塔吉克斯坦的农田、天然草地、林地及荒漠土壤中分离获得53株放线菌，分别归属于链霉菌属（Streptomyces）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、节杆菌属（Arthrobacter）、诺卡氏菌属（Nocardia）、放线菌属(Actinomyces)、Actinomycetales bacterium共6个属。其中Streptomyces是最大的种群，成为该地区土壤可培养放线菌的优势种群;Nocardiopsis、Actinomycetales bacterium、Nocardia为次优势种群;其余Actinomyces、Arthrobacter各只包含1株，属于稀少种群。塔国土壤可培养放线菌各项多样性指标显示，Simpson优势度指数为0.87; Shannon-Wiener多样性指数为2.6;Pielou均匀度指数为0.82。
　　3.对塔国土壤中所分离的110株细菌进行产功能酶筛选，共获得产淀粉酶菌株70株、产蛋白酶菌株56株、产纤维素酶菌株37株、产脂肪酶菌株16株。分别对产淀粉酶菌株和产蛋白酶菌株进行复筛，获得产淀粉酶酶活力最高的菌株为T-17，酶活力为18.067 U/mL;获得产蛋白酶酶活力最高的菌株为H2-2，酶活力为411.43 U/mL。对筛选出产淀粉酶活性较高的T-17菌株的粗酶学性质测定表明，该淀粉酶具有高温、中性、耐盐淀粉酶的特性，最适催化温度是70℃，30～70℃维持较高酶活力，最适催化pH值为7.0，pH值在较稳定6.0～8.0，有较强的耐盐特性，在4mol·L-1的NaCl浓度下仍能保持较高的酶活性，Ca2+和K+对酶具有较强的激活作用。经形态观察和分子生物学方法将T-17鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus malacitensis）。
　　4.从土壤分离的53株放线菌中，对棉花黄萎病原菌具有拮抗作用的菌株有13株，对棉花立枯病原菌具有拮抗作用的有11株，对棉花枯萎病原菌和黑曲霉具有拮抗作用的仅有2株，对番茄早疫病原菌具有拮抗作用的有7株，对柑橘绿霉病原菌具有拮抗作用的有5株，对稻瘟病原菌具有拮抗作用的有9株，对大肠杆菌具有抑制作用的有28株，对金黄色葡萄球菌具有拮抗作用的有28株，对枯草芽孢杆菌具有拮抗作用的有36株，对北疆辣椒细菌性叶斑病SW32具有拮抗作用的有10株。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 绪论

1．1 立题背景及研究意义

1．2 土壤微生物多样性及其部分活性物质研究

1．3 研究内容

1．4 技术路线

第2章 塔吉克斯坦土壤可培养细菌种群多样性分析

2．1 材料与方法

2．2 结果与分析

2．3 讨论

2．4 小结

第3章 塔吉克斯坦土壤可培养放线菌种群多样性分析

3．1 材料与方法

3．2 结果与分析

3．3 讨论

3．4 小结

第4章 塔吉克斯坦土壤细菌产酶特性研究

4．1 材料与方法

4．2 结果与分析

4．3 讨论

4．4 小结

第5章 塔吉克斯坦土壤放线菌拮抗菌株的筛选

5．1 材料与方法

5．2 结果与分析

5．3 讨论

5．4 小结

第6章 结论

参考文献

致谢

作者简介