转梨Lchi1基因烟草对腐烂病菌的抗性研究

摘要

梨是经济价值很高的作物，但其自身对病菌的抵抗力相对较弱，造成果树减产情况严重，其中梨树腐烂病是中国梨病害的一个重要分支。通过化学防治效果差且费工费时，因此，抗性育种成为果树科研工作者的重要研究对象。梨为多年生木本植物，童期较长，且高度杂合，采用传统方式筛选抗病品种，并对其子代进行抗病鉴定需要的时间较长。在这种情况下，对梨树进行分子层面上的改良，可以解决杂交育种的难题，缩短育种周期，提高育种效率，为果树育种开辟了一条新的道路。所以，基因源的获得和其功能探索是分子抗病辅助育种成功的关键。
　　本试验根据Genebank中已公布的不同植物的几丁质酶基因，分析得到保守片段，在梨基因组数据库中进行Blast比对，调取DNA序列，以高抗腐烂病品种‘小香水’(Pyrus ussuriensis Maxim.‘Xiaoxiangshui’)为研究材料，克隆获得梨几丁质酶Lchi1基因cDNA全长，并进行初步分析和基因转化功能验证。本研究的主要结果如下:
　　1.砀山酥梨基因组数据库中调取的DNA序列大小为2535 bp，含有3个外显子区(441bp、157bp、696bp)和2个内含子区(695bp、547bp)。‘小香水’序列比数据库调取序列多出(TCTTCG)6个碱基，可能会导致种与种之间的差异。
　　2.Lchi1基因全长1300bp，编码322个氨基酸，其蛋白的分子式为C1607H2407N415O468S17，分子量为35573.3Da，理论等电点为7.10。基于无规则卷曲和α-螺旋的二级结构，三级结构是高度保守的。Lchi1编码蛋白为可溶性胞外蛋白，存在少量潜在磷酸化位点，是糖苷水解酶第19族中的一员，存在信号序列，但是缺乏几丁质结合区。Lchi1基因属于CLASSⅡ几丁质酶基因，与其它科属植物的该类基因相似性均较高。
　　3.构建梨Lchi1基因的表达载体，通过农杆菌将该基因导入到烟草当中，对转基因T0-T2代烟草进行PCR及RT-PCR筛选。Lchi1基因已经转化到烟草中，并在T2代烟草中有效表达。4.利用离体叶片接种法，更直观地验证转Lchi1烟草T2代与梨腐烂病菌之间的抗性关系。接种腐烂病菌后，转基因烟草较未转基因烟草的抗腐烂病菌能力明显增强。梨几丁质酶基因Lchi1与腐烂病抗性相关联，可作为以后梨的抗腐烂病分子育种研究重要的基因来源。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词中英文对照

第1章 引言

1．1 植物抗病分子机制研究进展

1．2 植物抗病反应研究进展

1．3 植物防卫基因研究进展

1．4 植物几丁质酶基因研究进展

1．5 生物信息学研究进展

1．6 果树抗病转基因研究进展

1．7 本研究的内容、目的及意义

第2章 材料与方法

2．1 材料与试剂

2．2 试验方法

第3章 结果与分析

3．1 梨几丁质酶基因cDNA全长的获得

3．2 生物信息学分析

3．3 CDS片段的克隆

3．4 双元表达载体的鉴定

3．5 农杆菌介导的烟草遗传转化

3．6 转基因烟草T0-T2代的分子检测

3．7 转基因烟草T2代的抗病性

第4章 讨论

4．1 梨几丁质酶基因的克隆

4．2 梨几丁质酶基因生物信息学分析

4．3 梨几丁质酶基因的转基因功能鉴定

第5章 结论

参考文献

附录

致谢

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