NADH再生系统和乙醇突变株的构建及其生产1，3-丙二醇初步研究

摘要

还原力NADH是微生物产生1,3-丙二醇途径必需的物质。微生物在生成1,3-丙二醇的途径中伴随着很多副产物,如乙醇、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇(2,3-BD)等,这些副产物的生成与1,3-丙二醇产生途径竞争NADH。本工作一方而在野生型K. oxytocaM5al中引入NADH再生系统,另一方面将K. oxytoca M5al中产生乙醇的途径阻断掉,以使更多的NADH流向1,3-丙二醇产生途径。 在M5al中构建了NADH再生系统(pDK7-fdh),为了重组质粒pDK7-fdh能够在细胞繁殖过程中稳定遗传,在重组质粒pDK7-fdh中引入了质粒平均分配基因parDE得到重组菌株F6。F6在传代160代后质粒仅丢失3％,甲酸脱氢酶(FDH)酶活与传代前相比只降低了1.77％；而不含parDE的重组菌FY和F-1传代160代后质粒分别丢失了78％和93％,FDH比酶活分别降低了25％和49％。上罐检测甲酸脱氢酶酶活表明F6最高比酶活为26.32 U/mg,是M5al最高比酶活10.79U/mg的2.43倍。 F6摇瓶实验表明,加入甲酸脱氢酶的底物甲酸钠后,1,3-丙二醇的生产强度明显加强,发酵47 h达到0.3 g·l-1h-1,而没有加入甲酸钠的F6只有0.19 g·l-1h-1;且添加甲酸钠后副产物乙酸提高了7.2倍,乙醇产量提高了1.2倍。另外,F6和M5al发酵58 h的1,3-丙二醇产量并没有明显提高,分别是13.75g/l和13.16g/l,但是乙醇和乙酸的产量分别提高了24％和30％,且F6的生长加快。 另外,利用自杀载体pGPCm和pGPKm成功构建了aldH缺失突变株(MH)和adhE缺失突变株(ME)。比酶活测定结果显示,MH的ADH与M5al相差不大,分别为11.44U/mg和11.86 U/mg,而ALDH比酶活为0.796 U/mg,是M5al的22％；ME的ADH比酶活只有4.74 U/mg,是M5al的40％,ALDH比酶活是0.934 U/mg,为M5al的26％。在有氧和厌氧条件下,ME都几乎没有乙醇产生,而M5al乙醇最高产量分别为3.29 g/l和1.1 g/l。摇瓶发酵表明,在阻断了菌体的乙醇生成途径后,ME的生长速率明显降低,由此造成甘油消耗率降低,1,3-丙二醇的生成速率也随之降低。但是另一种化工和食品中十分有用的产物--2,3-丁二醇的生成却明显升高,发酵48 h 2,3-丁二醇的产量是10.23 g/l,比M5al提高了51％；延长发酵时间至72 h后1,3-丙二醇的产量最高为15.89g/l,2,3-丁二醇最高产量却达到了13.81g/l,M5al 1,3-丙二醇最高是17.38g/l,2,3-丁二醇只有6.58g/l,即ME 2,3-丁二醇的产量比对照提高了约1.1倍。与M5al相比,MH的乙醇产量并没有明显降低,1,3-丙二醇产量也无明显变化,而乙酸的产量却升高了。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第1章文献综述

1.1 1，3-丙二醇的性质

1.2化学法生产1，3-丙二醇

1.2.1环氧乙烷羰基化法

1.2.2丙烯醛水合法

1.2.3其它合成方法

1.3微生物法生产1，3-丙二醇

1.4甘油歧化1，3-丙二醇的代谢过程

1.4.1甘油歧化过程中的关键酶

1.4.2甘油歧化途径的改造

1.5利用基因工程菌生产1，3-丙二醇

1.5.1 dha调节子

1.5.2基因工程菌的构建策略

1.6微氧发酵

1.7辅酶NADH再生研究进展

1.7.1辅酶的电化学法再生

1.7.2辅酶的酶法再生

1.8 1，3-丙二醇的提取和纯化

1.9论文研究的目的和意义

第2章材料与方法

2.1材料

2.1.1仪器

2.1.2试剂

2.1.3菌种、质粒及引物

2.1.4培养基

2.1.5酶和试剂盒

2.2方法

2.2.1引物设计和PCR扩增

2.2.2 DNA产物的回收

2.2.3连接与转化

2.2.4质粒的提取

2.2.5 DNA酶切

2.2.6 DNA测序

2.2.7两亲本杂交-接合

2.2.8菌体培养液浊度及菌体浓度的测定

2.2.9发酵液甘油、1，3-丙二醇和副产物的测定方法-HPLC法

2.2.10重组菌甲酸脱氢酶活力测定

2.2.11质粒稳定性的测定方法

2.2.12蛋白质的测定方法

2.2.13热击用大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.14蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.15乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性的测定

第3章NADH再生系统的构建及parDE对其稳定性的影响

引言

3.1NADH再生系统在K.oxytoca M5al中的构建

3.1.1 PCR引物设计

3.1.2甲酸脱氢酶基因的获取

3.1.3中间载体pMD18-T Simple-fdh的构建和鉴定

3.1.4 NADH再生系统在K.oxytoca中的构建和鉴定

3.2质粒平均分配基因parDE对NADH再生系统稳定性影响

3.2.1重组质粒的构建

3.2.2不同重组质粒在产酸克氏杆菌中的稳定性

3.2.3重组菌株传代后fdh基因的表达

3.2.4重组菌株传代后甲酸脱氢酶活性的变化

3.3小结

第4章NADH再生系统对1，3-丙二醇合成的影响

引言

4.1甲酸脱氢酶在重组菌F6中表达及酶活的测定

4.2甲酸钠的添加对1，3-丙二醇合成的影响

4.2.1添加与不添加甲酸钠对1，3-丙二醇合成的影响

4.2.2添加pH 5.2和pH 7.0甲酸钠溶液对1，3-丙二醇合成的影响

4.2.3不同时间添加甲酸钠对对1，3-丙二醇合成的影响

4.3 NADH再生系统对1，3-丙二醇合成的影响

4.4小结

第5章乙醇途径敲除突变株的构建及鉴定

引言

5.1构建adhE和aldH基因敲除菌的思路

5.1.1与辅酶NADH相关的K.oxytoca代谢网络分析

5.1.2 K.oxytoca中乙醇合成途径分析

5.2自杀载体与染色体同源双交换原理

5.3 adhE基因和aldH上下两臂基因的扩增

5.3.1 adhE基因的扩增

5.3.2 aldH上下两臂基因的扩增

5.4 PCR产物的克隆及测序

5.5自杀载体的构建

5.5.1自杀载体pKEG的构建

5.5.2自杀载体pCHG的构建

5.6突变株的筛选

5.7突变株的鉴定

5.8小结

第6章突变株生成乙醇和1，3-丙二醇的变化

6.1 aldH缺失突变株(MH)和adhE缺失突变株(ME)比酶活的测定

6.2 aldH缺失突变株(MH)和adhE缺失突变株(ME)乙醇的产生

6.3 aldH缺失突变株(MH)和adhE缺失突变株(ME)1，3-丙二醇的生成

6.3.1第Ⅰ批发酵实验

6.3.2第Ⅱ批发酵实验

6.4 aldH突变株(MH)和adhE缺失突变株(ME)厌氧发酵乙醇的生成

6.5小结

第7章结论与展望

7.1结论

7.2展望

参考文献

附 录

致谢

作者简介