β-D-葡萄糖醛苷酶的糖基化位点突变及其催化特性研究

摘要

糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，对酶的结构和功能有着重要影响。课题组前期筛选到一株能定向转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的真菌Penicillium purpurogenum Li-3，并对其催化反应的β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因进行了克隆和Pichia pastoris GS115的重组表达系统的构建，但其催化特性和对甘草酸糖苷键的识别发生了改变，通过蛋白质糖基化染色初步判断可能是蛋白质翻译后修饰的不同引起的。针对β-D-葡萄糖醛酸苷酶P.pastoris GS115重组表达系统催化与底物识别存在的差异，本文以P.purpurogenum Li-3β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因为研究对象，开展了基因的糖基化位点分析及其定点突变，构建了各突变体的P.pastoris GS115表达系统，探索了糖基化对β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化特性的影响。研究结果如下：
　　 对P.purpurogenum Li-3β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因pgus进行分析，发现28、231、383和594位为潜在的N-糖基化位点，并运用重叠延伸PCR和大引物PCR的突变方法将pgus基因28、231、383和594位的天冬酰胺(AAC)突变为谷氨酰胺(CAA)，获得了四个突变体基因pgus-N28Q、pgus-N231Q、pgus-N383Q和pgus-N594Q。
　　 构建了N-糖基化位点突变基因的重组表达载体pPIC9K-N28Q、pPIC9K-N231Q和pPIC9K-N3830，并分别电击转化P.pastoris GS115进行表达，对比研究了β-D-葡萄糖醛酸苷酶28、231和383位N-糖基化位点突变前后酶学性质。结果表明：重组β-D-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)最适反应温度为45℃，而突变体PGUS-N28Q、PGUS-N231Q和PGUS-N383Q的最适反应温度分别为60℃、65℃和50℃；各突变体酶分别在65℃保温处理，与PGUS-P相比，酶活下降均较慢，突变酶的最适反应温度均有上升趋势，且温度稳定性增加，说明N-糖基化对酶的热稳定性有重要影响。PGUS-P最适反应pH为4.6，且具有较高的pH耐受性；突变酶PGUS-N28Q、PGUS-N231Q、PGUS-N383Q的最适pH分别为7.8、7.8、4.6和6.6，但其pH耐受性较差。28、231和383位的天冬酰胺突变后酶的最适反应pH值发生了迁移，说明糖链对酶蛋白的解离状态有重要影响。对比突变前后酶的催化能力，发现28、231和383位点突变后酶的比活力相对下降了36.4％、40％和58.8％，表明N-糖基化影响了酶与底物的结合。
　　 采用硫酸铵沉淀、凝胶层析、DEAE离子交换层析等方法对PGUS-P及其突变酶PGUS-N28Q、PGUS.N231 Q和PGUS-N383Q进行了分离纯化研究。表明：硫酸铵沉淀最佳浓度为70％，离子交换最佳洗脱液为0.2M NaCl的pH7.0磷酸钠缓冲液；纯化倍数为12，回收率为35.2％。经SDS-PAGE检测及蛋白迁移率的变化，结合酶催化特性结果表明28位、231位和383位发生了N-糖基化修饰。通过三维空间分子模拟，发现重组P.pastoris GS115表达的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的28、231和383三个N-糖基化位点均位于酶蛋白的外侧，此种结构理论上有利于翻译后糖基化修饰。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一章 文献综述

1.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶概述

1.1.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的来源

1.1.2 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的应用

1.1.3 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的结构与催化机理

1.1.4 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的研究现状

1.1.5 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的基因克隆研究

1.2 蛋白质的糖基化概述

1.2.1 糖基化类型

1.2.2 典型的蛋白质糖基化修饰系统

1.2.3 糖基化对蛋白质的影响

1.2.4 糖链的分析方法

1.2.5 糖基化作用的研究策略

1.3 斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统

1.3.1 P.pastoris的生物学特性

1.3.2 P.pastoris表达外源蛋白的优势

1.3.3 P.pastoris表达的蛋白质糖基化

1.3.4 糖基化对重组蛋白质产量的影响

1.3.5 糖基化对重组蛋白质功能的影响

1.3.6 影响糖基化的可能因素及避免过度糖基化的方法

1.3.7 影响外源蛋白在P.pastoris表达系统中分泌表达的因素

1.4 酶的分离纯化

1.4.1 酶的浓缩

1.4.2 酶的层析

1.5 论文研究的意义、内容及主要技术路线

1.5.1 论文研究的意义

1.5.2 论文研究的内容及技术路线

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 试剂

2.1.4 仪器

2.2 方法

2.2.1 微生物的培养

2.2.2 感受态细胞制备

2.2.3 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞

2.2.4 质粒DNA提取

2.2.5 重叠延伸PCR

2.2.6 电击转化及阳性克隆筛选

2.2.7 酶的诱导表达及活力测定

2.2.8 酶催化特性测定

2.2.9 对硝基苯酚标准曲线的绘制

2.2.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.11 糖基化酶总糖含量的测定

2.2.12 酶的分离纯化

2.2.13 β-D-葡萄糖醛酸苷酶质谱分析

第三章 N-糖基化位点的定点突变

引言

3.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶N-糖基化位点分析

3.2 N-糖基化位点的定点突变

3.2.1 N28Q突变体的获得

3.2.2 N231Q突变体的获得

3.2.3 N383Q突变体的获得

3.2.4 N594Q突变体的获得

3.3 小结

第四章 N-糖基化突变体基因的P.pastoris表达系统构建

引言

4.1 N28Q突变体的P.pastoris表达系统构建及其酶学特性

4.1.1 P.pastoris表达穿梭质粒pPIC9K-N28Q的构建

4.1.2 N28Q突变体P.pastoris表达系统构建

4.1.3 N28Q突变体的P.pastoris表达

4.1.4 PGUS-N28Q的酶学特性

4.2 N231Q突变体的P.pastoris表达系统构建及其酶学特性

4.2.1 P.pastoris穿梭表达质粒pPIC9K-N231Q的构建

4.2.2 N231Q突变体P.pastoris表达系统构建

4.2.3 N231Q突变体的P.pastoris表达

4.2.4 PGUS-N231Q的酶学特性

4.3 N383Q突变体的P.pastoris表达系统构建及其酶学特性

4.3.1 P.pastoris穿梭表达质粒pPIC9K-N383Q的构建

4.3.2 N383Q突变体P.pastoris表达系统构建

4.3.3 N383Q突变体的P.pastoris表达

4.3.4 PGUS-N383Q的酶学特性

4.4 N-糖基化位点突变后的酶催化特性分析

4.4.1 最适反应温度

4.4.2 最适反应pH

4.4.3 热稳定性

4.5 小结

第五章 重组P.pastoris β-D-葡萄糖醛酸苷酶的分离纯化及结构模拟

引言

5.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的分离纯化

5.1.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液的制备

5.1.2 硫酸铵分级沉淀与透析

5.1.3 DEAE sepharose.FF阴离子交换柱的分离

5.2 总糖含量测定

5.3 酶糖链的质谱分析

5.4 三维结构模拟

5.5 小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附 录

致谢

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