中国美利奴羊MHC classⅠ区段304D17BAC克隆基因成初步分析

摘要

目的:为研究中国美利奴羊MHC class I区段基因的结构组成,在构建的中国美利奴羊的cDNA文库和BAC文库的基础上:
　　 1.根据11克隆测序结果利用生物信息学方法预测分析中国美利奴羊MHC class I区段基因的结构组成。
　　 2.选取BAC文库304D17克隆制备放射性探针，通过噬菌斑原位杂交方法杂交筛选中国美利奴羊cDNA文库以实验分析此克隆的真实基因组成。
　　 3.根据304D17克隆测序结果用GenScan软件预测的基因设计引物，利用PCR扩增技术对不同绵羊品种的此基因进行扩增，以分析此基因的多态性。
　　 方法:
　　 1.将中国美利奴羊MHC class I区段的11个BAC克隆的测序序列结果放入GenScan，Fgenesh软件预测基因组成，将预测的每个基因输入NCBI公共数据库中进行BlastX比对分析，将得分最高的BlastX比对的结果放入在KEGG数据库进行基因注释。
　　 2.将中国美利奴羊MHC class I区段304D17 BAC克隆的测序序列用GeneQuest软件分析选择合适的限制性内切酶Bsaji，酶切后用放射性32P末端标记法标记探针，经探针纯化试剂盒纯化探针，利用噬菌斑原位杂交技术杂交筛选中国美利奴羊cDNA文库。将经放射性自显影筛选到的阳性克隆切除后送测序并对测序结果进行BlastX比对分析，以对此基因功能进行分析预测。
　　 3.选取GenScan预测的304D17克隆大片段长度的基因外显子，用Primer Premier 5设计引物对已有的绵羊品种的基因组进行PCR扩增，并将结果送测序后用生物信息学方法进行单核苷酸位点（SNP）多态性分析。
　　 结果与讨论:
　　 1.中国美利奴羊MHC class I区段的11个BAC克隆用GenScan共预测出基因数123个，其中编码基因位于MHC的7个，占预测基因总数的18％。未知基因39个，占预测基因总数的32％。
　　 2.限制性内切酶Bsaj I酶切结果与软件分析一致。探针纯化后放射性自显影与软件预测结果和酶切结果基本符合，可以用于杂交筛选。经多轮噬菌斑原位杂交共杂交出两个阳性克隆。BlastX比对结果显示为与免疫相关基因3.共对两个预测基因设计了引物。在几种绵羊品种中成功扩增的一个基因的多序列比对分析结果显示了丰富的SNP多态性。