小黑麦耐盐碱相关基因克隆及其功能验证

摘要

目的：土地盐渍化是严重影响农业生态环境、限制农业生产可持续发展的一个重要因素。盐碱耕地上种植的作物表现为大幅的减产甚至死亡。目前，培育优良的耐盐碱作物品种是解决这一问题的方法之一。因此，应用分子生物学及基因工程手段培育耐盐碱作物新品种已成为当前现代农业研究的重要内容之一。
　　 方法：本研究以六倍体小黑麦品种为主要研究材料，建立了小黑麦cDNA-AFLP技术，并以此为基础筛选到与盐胁迫相关的基因片段，采用RACE技术扩增到了碳酸酐酶cDNA全长，通过半定量RT-PCR和酶活性分析技术对该基因和蛋白表达进行了分析，并利用农杆菌介导法转化拟南芥技术对该基因的功能进行了验证。
　　 结果：
　　 1.利用cDNA-AFLP方法，采用64对引物从具有不同耐盐碱性能的小黑麦盐胁迫前后材料中筛选出了6个与耐盐性密切相关基因片段，如与磷酸酰丝氨酸脱羧酶、碳酸酐酶、受体类激酶、光系统II32kDa蛋白、光系统I疏水蛋白（PSI），应激反应蛋白的cDNA差异片段，首次在小黑麦育种上使用了cDNA-AFLP技术。
　　 2.以42号碳酸酐酶cDNA片段为基础，通过RACE技术扩增到了小黑麦碳酸酐酶（CA）全长cDNA，其序列长为1114bp，基因BANK登录号：GU145385，其中其 5′非编码区为24bp，开放阅读框长为778bp，3′非编码区为310bp，编码266个氨基酸。该小黑麦CA cDNA全长序列经在NCBI中的同源性比对，与大麦的β-CA基因（登录号：L36959.1）同源性为 92％。经Clustal x软件对其蛋白质结构预测表明，该CA基因所编码的蛋白质具有典型的β-CA基因家族的锌原子的结合残基，可初步断定其为小黑麦β-CA基因。
　　 3.运用酶活性分析和半定量RT-PCR技术，对该小黑麦CA基因在蛋白和分子水平的表达进行了研究。结果发现小黑麦幼苗叶片中的CA活性对盐胁迫胁迫反应灵敏。在抗盐性能不同的小黑麦品种间，CA活性对盐胁迫的响应也存在着差异，表明小黑麦CA是一个盐胁迫响应上调基因。
　　 4.初步建立了CA基因农杆菌转化拟南芥的体系，顺利的获得了T0代植株，为后期进一步研究其功能奠定了基础。
　　 结论：本研究建立了六倍体小黑麦耐盐基因克隆的cDNA-AFLP技术，克隆到了小黑麦碳酸酐酶（CA）基因cDNA全长，并经蛋白质和RNA水平上该酶的表达分析表明，该基因为一个盐胁迫响应基因，本研究为小黑麦耐盐碱分子育种提供候选基因和理论依据。