球孢白僵菌CXJ-1对棉蚜杀虫机理及其应用研究

摘要

棉蚜是近年来棉花发生的一种重要害虫，我国棉蚜防治主要手段是化学防治，化学农药大量施用已经造成严重的环境污染，使得该地区生态平衡受到破坏。使用环境友好的生物农药代替化学农药成为今后控制棉蚜的重要发展方向。球孢白僵菌是一种昆虫病原真菌，具有不杀伤非目标生物、安全、害虫难以产生抗性等优点，在棉蚜生物防治过程中起到重要作用。
　　本研究以从新疆北部沙漠边缘植物梭梭（H.ammodendron）上自然感染死亡的眩灯蛾（Lacydesspectabilis）上分离出两株白僵菌为供试菌株。经形态学和分子生物学方法鉴定为球孢白僵菌（Beauveria.Bassiana），采用浸虫法测定分离出两白僵菌，命名为白僵菌CXJ-1和白僵菌CXJ-2，两菌株在不同浓度下对棉蚜的室内毒力活性实验，筛选出对棉蚜最具毒力活性菌株，即球孢白僵菌CXJ-1；通过正交试验法筛选出球孢白僵菌CXJ-1与化学杀虫剂的最佳配方，以延缓棉蚜(Aphisgossypii)抗药性的产生和发展；利用Plackett-Burman法(PB)和响应面法(RSM)，对球孢白僵菌CXJ-1发酵工艺条件进行优化，提高了液体深层发酵中球孢白僵菌CXJ-1（BeauveriabassianaCXJ-1）的孢子量；由于几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起关键作用，通过对球孢白僵菌CXJ-1几丁质酶理化特性和基因克隆研究，旨在为该菌对棉蚜的杀虫机理提供酶学特性上的科学依据。主要研究成果如下：
　　1)采用浸虫法测定白僵菌CXJ-1和CXJ-2菌株在不同浓度下对棉蚜的室内毒力活性，试验结果表明白僵菌CXJ-1和CXJ-2菌株在孢子浓度4.75×109个/mL对棉蚜死亡率分别达到92.12％和90.88%，致死中浓度分别为4.37×105个/mL和1.08×106个/mL，致死中时间分别为3.54d和3.59d。分离获得的两株球孢白僵菌对棉蚜均具有较好的毒力活性，其中菌株CXJ-1毒力活性比CXJ-2高。
　　2)本研究采用小区喷雾施药法测定球孢白僵菌CXJ-1与吡虫啉对棉蚜的杀虫作用，通过正交试验法筛选出球孢白僵菌CXJ-1孢子与吡虫啉的最佳比例浓度。田间药效试验结果表明：当孢子浓度为108cfu/ml与0.03g/L吡虫啉混合时防治效果最好，11天对棉蚜死亡率达到82.15%，并对螨、瓢虫和草蛉，死亡率分别为72.73%，55.56%和53.57%。球孢白僵菌孢子与吡虫啉混合物对棉蚜具有较好的防治效果，可用于棉蚜防治。
　　3)采用单因素实验确定了产孢发酵条件最适初始pH、发酵转速和发酵温度。通过Plackett-Burman实验设计和Box-Behnken实验设计响应面分析优化，确定了球孢白僵菌CXJ-1产孢最佳发酵工艺参数为：温度28.07℃，转速198.95r/min，初始pH6.10，预测孢子浓度可达0.95×107个/mL，在优化发酵条件下进行验证实验，孢子浓度达到0.97×107个/mL，表明验证值和预测值有较高的拟合度。同上方法，确定了球孢白僵菌CXJ-1最适发酵培养基组成：玉米淀粉8.03g/L、荞麦粉14.20g/L、玉米粉8.83g/L、NH4H2PO41.13g/L、牛肉膏1.03g/L、酵母提取物1.97g/L、KCl0.93g/L、MgSO40.63g/L、K2HPO41.77g/L、FeSO40.0077g/L，在此培养基组分下进行发酵验证，实验值和模型预测值比较接近，有较高拟合度。球孢白僵菌CXJ-1孢子产量可达到5.81×107个/mL，比优化前提高了7.02倍。
　　4)通过对几丁质酶理化性质研究表明，该酶最适pH和最适温度分别为6.0和39℃，为酸性几丁质酶。几丁质酶的Km值为1.7118mg/mL。金属离子对几丁质酶活性影响较大，其中Fe2+和Cu2+对几丁质酶影响最为显著。
　　对白僵菌CXJ-1几丁质酶基因进行PCR扩增，与大肠杆菌（Escherichiacoli）克隆载体pMd18-T连接，获得含有球孢白僵菌CXJ-1几丁质酶基因的重组质粒并测序。对测序结果表明：该基因序列大小为1150bp，基因序列与球孢白僵菌（AY145440）、球孢白僵菌B-10（JF834544）、球孢白僵菌JYBb201-11（HQ435871）和NCIM1216（WU828354）几丁质酶基因的核苷酸同源性最高，同源性达到99%。

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引 言

第一章 绪论

1.1棉蚜对新疆棉花生产的影响

1.2棉蚜的防治技术

1.3球孢白僵菌研究进展

1.4本研究的目的和意义

1.5研究内容和技术路线

第二章 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

第三章 室内条件分离菌株对棉蚜毒力活性测定及其初步鉴定

3.1菌株的鉴定

3.2室内条件下两白僵菌对棉蚜防治效果测定

3.3 小结

第四章 小区条件球孢白僵菌CXJ-1防治效果测定及与吡虫啉最佳混用比例筛选

4.1小区条件CXJ-1对棉蚜毒力试验及与吡虫啉最佳混用比例筛选

4.2 孢子与吡虫啉最佳混用对棉蚜天敌的影响

4.3 小结

第五章 球孢白僵菌CXJ-1几丁质酶粗蛋白生化特性及基因克隆

5.1几丁质酶粗蛋白理化性质研究

5.2几丁质酶基因Bbchit1的克隆和序列分析

5.3 小结

第六章 球孢白僵菌CXJ-1液体发酵产孢工艺初步优化

6.1发酵产孢培养基优化

6.2发酵产孢条件优化

6.3 结论和讨论

第七章 结论与讨论

参考文献

简 介

致谢

石河子大学硕士研究生学位论文