大鼠脑组织中非编码RNA(microRNA)介导neuritin基因表达调控的研究

摘要

目的：本研究旨在探索大鼠短暂性全脑缺血损伤(TransientGlobalIschemia,TGI)后大脑皮层与海马组织中神经突起生长素(Neuritin,nrn1)和小RNA表达的变化规律，利用生物信息和分子生物学实验方法分析在神经修复过程中Neuritin受非编码小RNA的调控的可能性。为进一步研究Neuritin在神经修复中的作用及其调控因素奠定理论基础。
　　方法：采用夹闭双侧颈动脉(CCA-o)15min的方法成功构建大鼠短暂性全脑缺血再灌注(TGI)模型，于3、7、14、21天分别提取了处理组和手术对照组大鼠的大脑皮层与海马组织的总蛋白及总RNA作为后续分析实验样品。利用免疫印迹法分析了TGI后大脑皮层与海马组织中Neuritin的表达水平及其在不同的时间段内的变化；采用RT-PCR方法定性分析大脑皮层及海马组织中Neuritin基因(nrn1)及部分神经营养因子家族成员(NGF、BDNF、NT3、CNTF等基因)的表达；使用生物信息学软件(TargetScan,miRanda,PicTar等)对mirBase库中的miRNAs做了大规模的筛选以预测作用于Neuritin3’UTR靶位点的种子miRNAs。利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析海马组织中NeuritinmRNA和大鼠海马组织中预测的种子miRNAs的表达水平及其在不同时间段内的变化。
　　结果：成功构建了TGI动物模型，成活率高达95％。免疫印迹结果显示Neuritin蛋白在TGI后大脑皮层及海马中二周内表达明显增高。RT-PCR发现了TGI各组大鼠大脑皮层及海马均有nrn1和各种NTs(NGF,BDNF,NT3,CNTF)的表达，随后实时荧光定量PCR结果显示，nrn1mRNA在海马组织中也表现为伤后二周内表达水平明显升高，至21d回落，提示TGI后nrn1的表达受到某些因素的影响和调控。使用生物信息方法对miRNA与nrn13’UTR区潜在靶标进行预测分析，发现nrn1可能被rno-mir-204,-758,-543调控表达。对TGI后大鼠海马组织的荧光实时定量结果表明nrn1表达升高时mir-204的表达降低，rno-mir-204的表达与Nrn1基因的表达存在靶标的可能，提示miR-204可能通过结合nrn1靶标结合造成nrn1基因的降解或翻译抑制。
　　结论：研究结果提示mir-204在Neuritin表达调控过程中可能发挥作用。Neuritin基因在发挥神经修复与再生功能过程中可能受到某些转录后因素的调控。本研究为Neuritin调控机制的进一步阐明提供了基础数据，在神经发育及神经系统疾病的研究领域具有一定的研究意义。

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主要符号、缩略语、术语注释说明表

一、引言

二、利用生物信息学软件和方法预测调控Neuritin表达的miRNAs

2.1 材料与方法

2.2 结果

三、大鼠大脑缺血再灌注损伤模型的构建

3.1 材料与方法

3.2 结果

四 Neuritin及部分NTs在脑损伤动物模型中表达的分析

4.1 材料与方法

4.2 结果

五、Neuritin及种子mir-204在TGI大鼠海马中表达的定量分析

5.1 材料与方法

5.2 结果

六、总结与讨论

1 大鼠颈部手术的应用解剖

2 大脑缺血再灌注损伤动物模型构建的主要方法

3 模型构建的检验指标及部分实验生理学、病理学检查

4 大脑缺血再灌注损伤动物模型在分子生物学领域的应用

5 展望

参考文献

附录一

附录二

附录三

附录四

附录五

附录六

附录七

作者简介

致谢

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