重组BPI蛋白对感染绵羊支原体肺炎的盘羊杂交羊的免疫调节及治疗效果研究

摘要

目的：本试验以感染绵羊肺炎支原体(MO)的绵羊为疾病模型，使用重组 BPI蛋白(rBPI)治疗感染 MO的盘羊杂交羊，然后用 real-time QPCR与 ELISA的方法，测定 BPI和相关细胞因子的含量，用血常规方法检测血液各项生理指标，以研究 rBPI对感染 MO的盘羊杂交羊的免疫调节效果。
　　方法：（1）绵羊肺炎支原体的人工感染：将冻存的 MO菌种进行复壮培养，测定菌液浓度并稀释到备用浓度106CCU/mL。然后将6只巴什拜羊为 A组，12只盘羊杂交羊随机分为 B、C组，全部气管内注射绵羊肺炎支原体，每天观察临床症状并测量记录体温。两周后每组随机取3只试验羊的鼻腔分泌物，进行 MO的培养与生化鉴定，检测人工感染情况。（2）rBPI对感染 MO的盘羊杂交羊的治疗作用：在试验的第4 d，C组杂交羊使用纯化的 rBPI对其治疗，150mg/只/天，而 A组和 B组每天注射生理盐水，继续观察临床症状并记录体温。实验结束后将所有羊解剖观察肺脏病理变化，并制作病理切片进行病理评分，对比各组羊的差别。（3）rBPI对感染 MO的盘羊杂交羊的内源 BPI mRNA水平的影响：分别在感染前（0 d）、感染后第二天（2 d）、感染后五天（5 d）、一周（7 d）、两周（14 d）、三周（21 d），采血分离嗜中性粒细胞，用 real time-QPCR方法检测试验羊 BPI mRNA的相对表达水平。（4）rBPI对感染 MO的盘羊杂交羊的免疫调节作用：分别在第0 d、1 d、5 d、7 d、14 d、21 d，采血分离血清，用 ELISA方法检测试验羊 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ的含量，比较各组羊细胞因子的表达变化差异。（5）rBPI对感染 MO的盘羊杂交羊的血液部分生理指标测定：分别在第0 d、7 d、14 d，采集各组羊的外周血进行血常规检测。
　　结果与结论：（1）鼻腔分泌物用支原体专用培养基培养5d培养液变黄，葡萄糖发酵试验显示培养液由红变黄呈阳性；水解精氨酸试验显示培养液未变色呈阴性；洋地黄皂苷试验显示抑制带>0.3cm为阳性；氯化四氮唑还原实验显示琼脂培养基呈红色；红细胞吸附试验显示菌落表面布满红细胞，溶血试验为β溶血。说明鼻腔分泌物中含有MO，试验羊人工感染成功。（2）A组巴什拜羊在感染后2-3 d均表现为食欲减退、体温一过性升高（40-41℃）、呼吸啰音，无死亡病例，剖检后肺表面有轻微出血点；B组杂交羊体温升高（40-41℃）持续较久，有咳嗽、流浆液性鼻涕，甚至严重呼吸啰音及腹泻症状，其中2只死亡，剖检肺表面有不同程度的粉色肉变和肝变，有出血点和出血斑。C组杂交羊起初体温升高、食欲减退、咳嗽症状，剖检肺表面有出血点和出血斑。组织病理学评分结果：A组平均分为9.4，B组平均分19.9，C组平均分为12.8，B组评分显著高于A、C组（P<0.05;P<0.05）。说明杂交羊在治疗后临床症状及肺部炎症减轻。（3）在第7 d，C组BPI基因的相对表达水平显著低于A、B组（P<0.05），在第14-21d C组极显著高于B组（P<0.01），而在第7-14 d A组极显著高于B组（P<0.01）。说明了注射rBPI对体内BPI的表达水平有影响。（4）从感染后的第7-21d，C组的IL-1β含量分别极显著低于A、B（P<0.01）。在感染后的第7-21 d，C组IL-4含量分别极显著高于对照组A、B（P<0.01）；在第14-21d，A组IL-4显著高于B组（P<0.05）。第14-21 d，C组的IL-6极显著低于A、B组（P<0.01），A组也显著低于B组（P<0.05）。在感染后第7 d，C组IL-8浓度显著低于A组（P<0.05）；在第14-21d，B组的极显著高于A组（P<0.01;P<0.01）。在第5 d，C组IL-10显著高于A组（P<0.05），极显著低于B组（P<0.01）；在第14 d，C组极显著低于A组（P<0.01），显著高于B组（P<0.05）；在第21 d，C组显著低于A组（P<0.05），极显著高于B组（P<0.01）。在第14 d，C组IFN-γ含量显著高于A组（P<0.05）；在第21 d，C组显著低于B组（P<0.05），但极显著高于A组（P<0.01）。在感染第14 d，C组TNF-α显著低于B组（P<0.05），显著高于A组（P<0.05）；在第21 d，C组的TNF-α显著低于B组（P<0.05），但极显著高于A组（P<0.01）。（5）在感染前，杂交羊WBC、LYM、LYM％、RBC显著高于巴什拜羊，而MID、MID%、MCHC低于巴什拜羊。注射rBPI后，在第14 d，C组WBC、GRAN(109/L)及GRAN%显著低于B组(P<0.05)，而LYM%、MCHC显著高于B组(P<0.05)。说明注射BPI对杂交羊的血液生理指标有一定影响。

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前 言

第一章 文献综述

1 杀菌性/通透性增加蛋白研究进展

2 绵羊肺炎支原体研究进展

3 相关细胞因子研究进展

4 ELISA 技术的研究进展

5 荧光定量 PCR 技术研究进展

6 血常规研究

第二章 绵羊肺炎支原体的人工感染

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 rBPI 对感染 MO 的盘羊杂交羊的治疗作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 rBPI 对感染 MO 的盘羊杂交羊的内源 BPI mRNA 水平影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第五章 rBPI 对感染 MO 的盘羊杂交羊的免疫细胞因子调节作用

1 材料方法

2 结果

3 讨论

第六章 rBPI 对感染 MO 的盘羊杂交羊的血液生理指标影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

创新点

参考文献

致谢

作 者 简 介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表