绵羊诱导多能性干细胞的制作与鉴定研究

摘要

2006年，山中申弥利用病毒载体将四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc）感染小鼠体细胞，获得了类胚胎干细胞的诱导多潜能性干细胞（iPS细胞），为细胞学研究提供了新的方向，也为再生医学领域带来了广阔的应用前景。动物 iPS细胞的出现对疾病模型的建立、细胞治疗，种质资源的保存、改善体细胞克隆动物的生产效率等方面都有着重要的意义。
　　目的：在无饲养层条件下建立电穿孔转染五因子制备绵羊 iPS细胞，掌握 iPS细胞诱导这一技术，为进一步研究细胞重编程机制及未来 iPS细胞的临床应用奠定基础。
　　方法：1本实验采用组织培养法，双酶法分离出中国美利奴成纤维细胞，并进行传代培养。2将含有人的 Oct4；Sox2、Klf4；l-Myc、lin28基因的3个质粒，分别采用4-D电转染仪中 EH-100，EN-150，CZ-167，CA-137四个电转程序转染到绵羊成纤维细胞中，筛选出最适合绵羊成纤维细胞的电转染程序；细胞密度和质粒浓度均相同，质粒浓度不同对 AP染色阳性（AP+）克隆的影响；细胞密度，质粒浓度均一致，质粒比例不同，对 AP+克隆的影响；细胞密度，质粒浓度，质粒浓度均一致，培养液中有无添加Vc，对 AP+克隆的影响，以选出最适合制备 iPS的方案。3通过外形观察、定量 PCR、免疫荧光染色、转录组分析等来检测所制备的绵羊类 iPS细胞。
　　结果与结论：（1）双酶法快速成功分离出中国美利奴绵羊耳源成纤维细胞，为重编程的提供优良的体细胞。（2）采用 EH-100电转程序，细胞密度为5×106个/mL，质粒比例1:1:1，质粒质量浓度为0.1 mg/L，培养液中添加0.05 mg/L Vc条件下，AP染色阳性（AP+）克隆形成率达14％，优化的电转染的方法和培养方案有效提升了绵羊类诱导性多潜能干细胞的制备效率。（3）在无饲养层条件下，通过电转染法将五因子导入绵羊耳源成纤维细胞，并成功重编程为类 iPS细胞，在外观形态、多能基因的表达、转录组等方面的鉴定结果都表明其具有多潜能性，为以后进一步研究绵羊多潜能干细胞机制奠定了基础。

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前言

第一章 文献综述

1 iPS 细胞（诱导多潜能干细胞）

2 多能性相关转录因子在维持细胞多能性中的作用

3 多能性相关转录因子诱导细胞多能性的分子机理

4 多种不同的制备 iPS 细胞的方法

5 iPS 细胞研究历程

6 绵羊 iPS 细胞最新研究进展

第二章 实验研究

实验一 中国美利奴成纤维细胞的原代和传代培养

实验二 电穿孔转染制备绵羊诱导多潜能干细胞方法的优化

实验三 绵羊诱导多潜能干细胞鉴定

实验四 转录组测序分析

第三章 总结

结论

创新点

参考文献

致谢

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