青霉菌侵染前后哈密瓜几丁质酶基因的克隆及表达变化研究

摘要

哈密瓜是新疆地区重要的经济作物，但是采后贮运过程中的腐烂，给哈密瓜产业造成了很大的经济损失。导致腐烂的主要原因之一是病原真菌的侵染，因此控制病原真菌的侵染是解决这一问题的重要途径。在哈密瓜受到病原真菌的胁迫时，会首先启动自身的抗性相关蛋白，构成抵御侵染的第一道防线。几丁质酶是一种重要的病程相关（PR）蛋白，多种研究表明几丁质酶对植物应对生物胁迫有积极作用。
　　目的：本实验通过克隆哈密瓜中两个与抗病相关的几丁质酶基因片段，运用软件对其进行生物信息学分析，并研究在哈密瓜受到青霉菌侵染后，这两个几丁质酶基因表达量的变化，及几丁质酶活性的变化，推测基因表达与酶活性之间的关系，为研究哈密瓜应对生物胁迫的分子机制提供基础，同时也为哈密瓜的生物保鲜提供理论基础。
　　方法：根据课题组前期获得的哈密瓜转录组文库，筛选本研究中的几丁质酶基因，采用RT-PCR技术克隆这两个几丁质酶基因片段；运用多种软件分析这两个基因的开放阅读框，推测氨基酸序列，预测所编码蛋白的理化性质、信号肽、二级结构、亚细胞定位等；运用RT-qPCR技术分析哈密瓜受到青霉菌侵染后，这两个基因的表达量；采用还原糖测定法，测定侵染后哈密瓜几丁质酶活性的变化。
　　结果与结论（：1）将克隆所得到的两段序列分别命名为HmCHI与HmCHT-2，提交NCBI Genebank数据库获得登录号分别为KX083345和KX083346。其中HmCHI长1153 bp，最大开放阅读框为445个核苷酸，编码145个氨基酸，通过比对确定其为Class III几丁质酶基因，属于18家族。通过软件预测其所编码蛋白分子量为15.04 ku，理论等电点8.82，为疏水性蛋白，有一个信号肽，为非跨膜蛋白，定位于细胞间隙。HmCHT-2长1011 bp，最大开放阅读框为936个核苷酸，编码312个氨基酸，通过CDs分析确定其为19家族Class Ia类几丁质酶基因。预测HmCHT-2所编码蛋白分子量为33.81 ku，理论等电点8.42，为亲水性蛋白，有一个信号肽，无跨膜结构域，定位于液泡。
　　（2）荧光定量结果表明，哈密瓜受到青霉菌侵染后HmCHI基因的表达量持续上升，在第60 h达到最大值，表达量明显高于对照组，高表达量持续时间久。而受侵染后HmCHT-2表达量总体呈上升趋势，前48 h，表达量上升缓慢，在第60 h时，表达量上升幅度突然增大，在72 h相对表达量达到最大，实验组的表达量高峰出现时间较晚，上调幅度则远大于对照组。而对照组两个基因的表达量都是在24 h达到峰值，之后下降。说明HmCHI与HmCHT-2在哈密瓜对于青霉菌侵染的先天免疫应答过程中都发挥重要作用，HmCHI先于HmCHT-2发挥作用，但HmCHT-2的上调幅度大于HmCHI。
　　（3）酶活性测定结果表明，接菌后哈密瓜几丁质酶活性迅速上升，在第48 h达到最大值后下降，对照组的几丁质酶活性持续缓慢的上升，始终低于实验组，说明青霉菌的侵染会诱导几丁质酶的活性发生变化。青霉菌侵染诱导哈密瓜中几丁质酶基因表达量上调、酶活性增高；酶活性与几丁质酶基因的表达量的变化趋势基本相符。

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第一章 文献综述

1.1 哈密瓜采后病害研究现状

1.2 植物与病原菌相互作用

1.3 植物几丁质酶研究现状

1.4 实时荧光定量PCR技术及其应用

1.5 研究目的及意义

第二章 哈密瓜中两个几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 青霉菌侵染前后HmCHI与HmCHT-2基因表达量的研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 哈密瓜中几丁质酶活性测定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 结论

1. 哈密瓜HmCHI的克隆

2. 哈密瓜HmCHT-2的克隆

3. 青霉菌侵染后哈密瓜HmCHI的表达变化

4. 青霉菌侵染后哈密瓜HmCHT-2的表达变化

5. 青霉菌侵染后哈密瓜几丁质酶活性的变化

6. 总结

7. 创新点

参考文献

致谢

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