KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶对纤维环细胞增殖、表型及功能影响的实验研究

摘要

目的：
　　本实验旨在探究KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶在体外实验中对兔纤维环细胞增殖、表型及功能的影响，寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞、细胞支架及生长因子。
　　方法：
　　胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔腰椎纤维环内层细胞，体外培养至第3代，与KLD-12多肽纳米纤维凝胶及TGF-β1复合，制备KLD-12多肽/TGF-β1/纤维环细胞纳米纤维凝胶（实验组）和KLD-12多肽/纤维环细胞纳米纤维凝胶（对照组），体外培养14 d。倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化；细胞计数试剂盒（cell count kit8，CCK-8）法检测细胞增殖活性；钙黄绿素（Calcein-AM）/碘化丙啶（PI）双荧光染色观察凝胶内活细胞与死亡细胞，并计算活细胞比率；阿尔新蓝法检测培养基中葡萄糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）含量；免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测纤维环细胞中Ⅱ型胶原及聚蛋白多糖（Aggrecan）基因表达情况。
　　结果:
　　（1）倒置显微镜观察复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形，少部分在凝胶边缘处贴壁生长的细胞呈多角型或长梭型。
　　（2）CCK-8细胞增殖实验结果显示：实验组与对照组细胞增殖活性随培养时间延长呈非直线性增加趋势，实验组细胞增殖活性高于对照组（P<0.05）。
　　（3）Calcein-AM/PI双荧光染色观察示：培养14d后，实验组和对照组凝胶内细胞活细胞比率分别97.44％±0.86%和94.04%±3.27%，比较差异无统计学意义（P>0.05）。
　　（4）GAG检测示，实验组细胞分泌GAG含量随培养天数增加呈非直线上升，8 d达平台期；对照组GAG含量随时间上升至第8d达峰值，随后含量下降。第5、8d实验组GAG含量较对照组增多，差异有统计学意义（P<0.05），第11、14d时，实验组GAG含量较对照组分泌稳定，且具有显著性差异(P<0.01)。
　　（5）免疫荧光染色示实验组与对照组细胞中II型胶原正常分泌，实验组中II型胶原含量显著高于对照组（P<0.01）。
　　（6）RT-qPCR检测示，实验组及对照组凝胶内纤维环细胞均可见II型胶原和Aggrecan基因表达，实验组II型胶原及Aggrecan mRNA相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。
　　结论:
　　KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶具有生物活性，且可促进纤维环细胞增殖，维持细胞活性，提高GAG、II型胶原及Aggrecan等细胞外基质分泌。

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缩略语表

前言

材料与方法

1 材料

2.方法

3. 统计学分析

结果

1.KLD-12多肽检测结果

2.细胞实验结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述： 椎间盘组织工程研究进展

致谢

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