哈萨克马不同发育阶段睾丸miRNA鉴定与差异表达研究

摘要

随着新疆现代马业的兴起，哈萨克马作为珍贵的地方马品种资源应予以保护。已知哺乳动物生殖细胞在一些减数分裂基因表达调控下进行发育和分化，睾丸内大量基因的表达是受到转录后调控机制的控制。miRNA是一类非编码的小分子RNA，在真核生物基因组中，它们调控基因转录后表达，研究发现在精子发生的某些关键步骤中必需依靠miRNAs分子调控，近年来高通量测序技术的发展，越来越多的研究分析了在不同物种睾丸不同发育阶段miRNA表达谱的差异性，但是对于马睾丸miRNA表达谱的研究还未见报道。
　　为了解哈萨克马不同发育阶睾丸组织形态特点，不同阶段马睾丸组织中miRNAs的鉴定与差异表达情况，以及 miR-34家族在马不同组织中的表达规律，本研究是在前人的研究基础上，共采集马驹，周岁马，3岁以上共计26匹马的睾丸组织，测量并记录完整睾丸组织的长度、周长、年龄、编号等数据；采用石蜡切片技术制备所有样品的组织切片（HE染色和卡红染色），每个组织切片挑选30个正圆或接近正圆形的曲精细管，测量其直径，统计曲静细管内不同种类生殖细胞的数量。根据组织切片的结果，确定需要对马驹，周岁马和5岁以上马睾丸组织测序。从马睾丸内提取RNA，然后反转录为cDNA，利用Solexa高通量测序，将clean序列在马基因组数据库和NCBI Genebank和 Rfam数据库中进行比对，结合生物信息学分析鉴定 miRNA；对预测到的靶基因进行功能注视（GO分析和KEGG分析）。运用荧光定量PCR的方法对马睾丸、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌和脂肪组织中的miR-34家族表达规律进行分析研究，得出以下研究结果：
　　1.哈萨克马驹到成年马的发育过程中，睾丸逐渐变大，3岁马睾丸的宽度和长度显著小于成年马（p＜0.05）。3岁马曲精细管的直径和细管内的精子数也小于成年马，精子细胞数之间没有显著差异，哈萨克马幼驹的曲精细管尚未发育完整，周岁马的曲精细管已经形成，睾丸间质细胞数量多，3岁公马生殖细胞种类完整，但精子细胞和精子数量较少；5-12岁马生殖细胞种类完全，精子细胞和精子数目较多。
　　2.在三个文库分别得到了9250474(马驹)，9820184(周岁马)，和9813836(公马)原始序列马驹和周岁马文库中的短链RNA呈现正太分布，在21-23nt有一个高峰，对应miRNAs的表达；成年马文库为双峰分布，在22-23nt有一个强峰，在25-27nt有一个弱峰，分别对应miRNAs和piRNAs。马驹、周岁马和公马文库中分别发现了375个，391个和388个已知和保守的miRNAs，发现了47个，111个，和78个novel miRNAs。根据睾丸发育三个阶段的miRNA差异分析，miRNA被分为9组，其中constant-up组含有48个miRNAs，包括4个已经被验证的与精子发生最为相关的miRNAs:miR-34b，miR-34c，miR-449a和miR-449b。GO和KEGG pathway分析表明，constant-up组与细胞增殖和癌症有关。
　　3. miR-34a在马驹的肝脏、肺脏和成年公马的脾脏呈现高表达，在马驹，周岁马和成年公马的睾丸，成年公马的肺脏、肾脏以及马驹的肾脏和心脏内适度表达，在马的肌肉和脂肪内表达量均较低；miR-34b在马驹肺脏呈高表达，在成年马的脾脏、肾脏，睾丸和肺脏和马驹肾脏一般表达，在心脏、肝脏、脂肪和肌肉表达量均较低；miR-34C在马驹肺脏高表达，在成年马的脾脏、肾脏、肺脏，睾丸和马驹肝脏和肾脏一般表达，在心脏、肌肉和脂肪内表达量均较低。miR-34a在所有发育阶段马睾丸内相对表达量较为稳定， miR-34b和 miR-34c在成年马阶段出现明显上升，成年马 miR-34b和miR-34c表达量与马驹和周岁马表达量有极显著的差异（p＜0.01)。马的miR-34家族在5’端有相同的“种子序列”(GGCAGUG)。miR-34a与miR-34b和miR-34c分别具有86％和82%的同源性。数据显示miR-34b和miR-34c在马体内多个组织有相似的表达模式。
　　分析上述结果本研究得出如下结论：
　　1.在哈萨克的发育过程中，5月龄马（马驹）的睾丸还未发育，有睾丸索；1.5岁马（周岁马）睾丸的曲静细管正在发育，没有精子发生；3岁马的曲静细管发育完全，但睾丸直径，曲静细管内的精子细胞和精子略微小于发育完全的公马；5岁以上马（成年马）曲静细管发育完全内各类生殖细胞多，表明生殖功能活跃。
　　2.在三个文库中，本研究发现了459个已知和保守的miRNA，其中马驹文库有375个，周岁马文库有391个，公马文库有388个；piRNA（25nt、26nt、27nt）在公马（成熟）睾丸中表达量超过短链文库中的三分之一，与精子发生和减数分裂密切相关，本文预测睾丸组织中的piRNA很可能是今后动物生殖发育的一个热点。
　　3.在马发育过程中miR-34a在多种组织中广泛表达，而miR-34b和miR-34c的表达具有明显的组织特异性；miR-34b的表达变化曲线与miR-34c的变化曲线基本平行；位于同一基因簇上的miR-34b和miR-34c具有极为类似的表达模式和分子结构，本研究分析认为马的miR-34b和miR-34c也具有冗余功能。

目录

声明

缩 略 词 表

前言

第一篇 文献综述

第一章 miRNA研究进展概述

1 miRNAs的发现

2 miRNA的生物合成过程

3 miRNA的判定标准

4 miRNA的作用机制

5 miRNA生物学功能的研究方法

6 miRNA与临床疾病

1 哺乳动物精子发生与miRNA的相关研究

2 piRNA

3 马睾丸与公马繁殖力研究现状

4 小结

第二篇 试验研究

第三章 哈萨克马不同发育阶段睾丸组织学观察与分析

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

5小 结

第四章 马睾丸组织miRNAs的鉴定与差异表达研究

1材料

2方法

3结果

4 讨论

5小结

第五章 miR-34家族在马不同组织中的表达规律

1材料

2方法

3 结果

4 讨论

5小结

结论与创新

参考文献

附录

附表1

附表2

附表3

附表4

附表5

附表6

附图1

附表7

附图 2

附表8

附表9

致谢

作者简介

导师评阅表