人DAF、CD59基因特异表达载体的构建及其在猪血管内皮细胞表达的研究

摘要

我们课题组将建立在血管内皮细胞特异表达人双补体调节蛋白（CD59和DAF）的转基因猪.构建携有人ICAM-2启动子的CD59、DAF基因的特异表达载体,以及在猪血管内皮细胞（PEC）检测重组基因的表达,是建立此转基因猪的上游工作.我们课题组业已完成的工作：①从人血基因组中克隆了ICAM-2启动子片段,克隆了CD59基因第一内含子起增强子作用的DNA片段,与国外惠赠的CD59cDNA基因重组,构建了pcDNA3-En-ICAM2-CD59cDNA表达载体及不含增强子pcDNA3-ICAM2-CD59cDNA表达载体.②类似上述的方法,构建了人ICAM-2作启动子的DAF基因表达载体.pcDNA3-ICAM2-Intronl-DAFcDNA.③分别构建了检测ICAM-2启动子活怀及包括内含子片段在内的启动子活性的绿色荧光蛋白报告基因.④培养并鉴定猪血管内皮细胞,培养猪耳成纤维细胞.用脂质体包裹南粒转染方法,将上述表达载体及报告基因分别转染猪血管内皮细胞及成纤维细胞.⑤通过荧光显微镜检测报告基因的表达;通过流式细胞仪,对CD59表达载体在PEC中瞬时表达进行了检测;通过流式细胞仪和RT-PCR方法对抗G418转pcDNA3-ICAM2-intronl-DAFcDNA表达载体的PEC进行表达测定.⑥筛选、克隆表达DAF蛋白的PECs,利用与含政党人血清M199共孵育方法,检测乳酸脱氢酶漏出率,评价表达DAF蛋白PECs抗人血清溶破的功能情况.

目录

前言

研究工作

第一部分人DAF、CD59基因特异表达载体的构建

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分人DAF、CD59基因特异表达载体在猪血管内皮细胞的表达及抗人血清溶破实验

实验一猪血管内皮细胞的培养与鉴定

材料和方法

结果

讨论

参考文献

实验二人DAF、CD59基因特异表达载体在猪血管内皮细胞的转染及筛选

材料和方法

结果

讨论

参考文献

实验三人DAF、CD59基因特异表达载体在PEC表达及稳定转染子抗人血清溶破实验

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述Ⅰ异种移植中转基因动物策略研究进展

综述Ⅱ外源基因在哺乳动物细胞表达研究现状

缩略词表

致谢