树突状细胞诱导供体脾淋巴细胞过继性免疫治疗预防肝移植术后肝癌复发的实验研究

摘要

第一部分大鼠肝移植急性排斥反应模型的建立目的：掌握大鼠肝移植模型的制作方法，结合国内外报道，对大鼠肝移植模型进行技术改进，并观察以SD大鼠为供体Wistar大鼠为受体时免疫排斥反应发生的情况，建立稳定的大鼠肝移植急性排斥反应模型。 材料和方法：应用Kamada“二袖套法”行大鼠肝移植，在既往国内外文献报道的基础上对供肝切取、灌注、袖套管制作、受体麻醉、肝上下腔静脉吻合和缩短无肝期等方面进行改进，熟练实验操作。行SD→Wistar大鼠肝移植20例，并随机分为排斥反应组、环孢霉素A处理组(CsA，5mg/kg)各10例，以Wistar→Wistar同系移植组10例作为对照组，观察移植术后免疫排斥情况。结果：供体手术时间29.6±5.2min，供肝修整时间20.1±3.3min，受体总手术时间45.7±5.9min，受体无肝期17.2±2.4min，肝上下腔静脉缝合时间10.5±2.2min，手术成功率93.3％。排斥反应组大鼠术后逐渐出现黄疸、腹水等表现，肝功能进行性恶化、最终出现肝功能衰竭症状而死亡，生存期5～15天，组织病理学提示有典型的免疫排斥，而对照组和CsA治疗组大鼠均存活1月以上。术后第7天排斥反应组血清IFN-γ、IL-4水平显著升高，而应用CsA治疗组血清IFN-γ和IL-4水平处于低水平。 结论：对大鼠肝移植技术进行改良可明显提高移植大鼠的生存率。以SD大鼠为供体，Wistar大鼠为受体的组合为高排异组合，可以建立稳定的肝移植急性排斥反应模型。IFN-γ是排斥反应中起作用的主要细胞因子，它的高表达可以引起同种异体大鼠肝移植的排斥反应，是一个良好的检测排斥反应的指标。CsA抑制了T淋巴细胞的激活和向Th1、Th2型细胞的分化，从而抑制宿主的免疫排斥反应，但并未使移植肝脏向着免疫耐受的方向发展。 第二部分大鼠肝癌肝移植术后肝癌复发模型的建立目的：通过大鼠肝癌肝移植后免疫抑制的状态下接种肿瘤组织块来模拟临床中同种异体肝移植后肝癌复发的进程，在总结既往建模方法的基础上经过改进，建立稳定的肝移植后肝癌复发模型，为术后进行预防、治疗复发，观察疗效和各种治疗对供肝的影响提供研究平台。 材料和方法：应用Wistar大鼠肝癌细胞系CBRH-7919(中科院上海细胞库)经过培养传代、皮下成瘤、肝内接种等过程建立了大鼠的种植性肝癌模型。行SD→Wistar的大鼠移植，免疫抑制状态下肝内植入瘤块，分为肝移植术中植瘤组和术后1周植瘤组，并以免疫抑制状态下的未行移植的Wistar大鼠作为对照组，观察各组大鼠的成瘤率，在B超下观察肿瘤生长情况，绘制生长曲线。 结果：大鼠皮下注射癌细胞2周后，可见鼠膝部接种部位皮下有明显隆起的结节状肿物，直径0.94±0.21cm(n=5)，镜下见瘤细胞核大，深染，细胞大小不等，形态不规则，核浆比例大，核分裂易见，形态学符合肝细胞癌表现。肝移植术中植瘤组5只大鼠仅1只成瘤，成瘤率为20％，对照组和术后植瘤组各5只大鼠全部成瘤，成瘤率为100％。术中植瘤组大鼠肿瘤生长速度明显降低。结论：肝移植术后1周在免疫抑制的状态下肝内接种瘤块成瘤，建立了和临床过程较为一致的肝移植术后肝癌复发的大鼠模型，该模型模拟了临床上同种异体肝移植应用免疫抑制剂抑制排斥反应的发生，同时也模拟了肝癌的复发，是安全、可靠的建模方法。同时该模型模拟了肝移植后肝癌肺转移的过程。 第三部分树突状细胞诱导供体脾淋巴细胞对肝移植受体肝癌复发的作用目的：探讨肝癌肝移植后应用负载受体肝癌抗原的树突状细胞(DC)诱导活化供体脾脏来源的特异性淋巴细胞，对受体肝癌实施过继性免疫治疗的可行性和有效性，以期在不引起对移植肝损伤或排斥的情况下，产生更为有效的针对肿瘤细胞的杀伤作用，寻找有效减少肝癌肝移植的术后肝癌复发的免疫治疗新方法。 材料和方法：以培养粘附法体外分离培养Wistar大鼠骨髓DC前体细胞，加入细胞因子rrGM-CSF和rrIL-4联合诱导培养5天，经倒置显微镜形态学观察、免疫组化鉴定证实培养细胞具备DC典型特征，并与Wistar大鼠肝癌细胞CBRH-7919反复冻融制成的裂解物抗原共同孵育2天，形成负载癌抗原的DC细胞。以此DC细胞分别诱导受体、供体来源的癌抗原预致敏的脾细胞作为两个实验组C、D，以低剂量IL-2维持培养的受、供体脾细胞作为对照组A、B。对比活化、非活化和供体来源、受体来源的脾淋巴细胞在体外对受体肿瘤细胞的杀伤活性，检测培养上清液IFN-γ水平。以上述不同来源和处理的脾淋巴细胞对SD→Wistar大鼠肝移植后肿瘤复发模型行过继性免疫治疗，以盐水作为对照组E，每组6只大鼠，观察各组免疫治疗对于肿瘤浸润淋巴细胞、成瘤率、肿瘤生长情况、大鼠生存情况、肝脏损害、供肝的排斥反应、受体不良反应和受体体内细胞因子的影响。 结果：体外实验结果显示，DC诱导脾细胞过程中，供体脾细胞活化组培养上清液IFN-γ分泌最高，活化组较未活化组有明显的升高。经负载癌抗原的DC诱导的脾细胞对肝癌细胞的杀伤活性较未经抗原诱导的脾细胞明显增强，供体来源的脾淋巴细胞经抗原诱导后对肝癌细胞的杀伤活性较受体来源脾淋巴细胞显著增强，未经抗原诱导的供受体脾细胞对肝癌细胞未发现明显的杀伤作用。体内实验显示：负载癌抗原的DC诱导的供体脾细胞回输体内后，在移植后大鼠体内观察到了肿瘤浸润淋巴细胞的增多，肿瘤细胞坏死，肿瘤生长的延迟，成瘤率的下降和生存期的延长，同时，免疫治疗前后肝功能无明显变化，未观察到供肝中重度排斥反应的发生，受体能够很好的耐受这种免疫治疗，未发现可见的不良反应和由于免疫治疗引起的死亡。受体来源经抗原诱导的脾细胞体内对肿瘤的生长也显示出了一定的抑制作用，如生存期的延长，肿瘤生长有所减慢，但与供体脾细胞诱导后的抑瘤作用具有显著性差异，复发率并没有明显下降，且观察到受体血清转氨酶的一过性升高。未经抗原诱导的供受体脾细胞回输后未产生明显的抗肿瘤效果。各种针对肿瘤的免疫治疗方案并未引起受体循环中Th1、Th2型细胞因子水平的显著提高，未观察到移植肝2、3级排斥反应的发生。 结论：负载癌抗原的DC诱导供体脾淋巴细胞对肝移植受体进行过继性免疫治疗对于该动物模型是一种实用、安全且有效的免疫治疗方案，可以在不影响移植肝功能、不增加对移植肝排斥反应的同时，降低术后复发率、减慢复发瘤生长速度、延长生存期，较肝移植受体来源的免疫细胞具有更强的治疗效果和更小的肝脏损害。

目录

论文说明：英文缩写

学位论文原创性声明及学位论文版权使用授权书

摘要

研究背景

第一部分 大鼠肝移植急性排斥反应模型的建立

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

附图

第二部分 大鼠肝癌肝移植术后肝癌复发模型的建立

第三部分 树突状细胞诱导供体脾淋巴细胞对肝移植受体肝癌复发的作用

前言

技术路线图（图3.1）

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

致谢