新型组织工程皮肤种子细胞—毛囊干细胞的实验研究

摘要

皮肤是人体最大的器官，皮肤除了表皮、真皮结构以外还有毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器官，构成了机体与外界接触的机械屏障，具有多种重要的生理功能。当皮肤遭受严重烧伤、创伤、感染及各种原因导致的皮肤损伤时，大面积皮肤缺损的快速修复成为棘手的问题。组织工程概念的提出为大面积皮肤损伤的修复提供了新的思路。组织工程皮肤中种子细胞的研究一直是研究的热点。毛囊是皮肤组织中的附属器官，毛囊中存在有高增殖活性和多分化潜能的干细胞即毛囊干细胞(FSC)。FSC作为一种新型的皮肤种子如何在体外大量增殖，关键在于筛选出快速获取FSC的分离技术，优化种子细胞的培养微环境，这已经成为组织工程皮肤种子细胞研究亟待解决的问题。 目的： 1．建立高效、快速的FSC分离和培养技术，优化FSC体外培养微环境。 2．观察体外培养的FSC生物学特征及传代培养的FSC的细胞周期分布。 3．比较FSC和表皮干细胞(ESC)生物学特征。 4．观察真皮来源的成纤维细胞(FB)对FSC增殖和分化潜能的影响。为FSC成为一种新型皮肤种子细胞提供实验依据。 方法： 1．分离、纯化兔触须部FSC，比较“快速分离法”和“两步酶”法的差异，通过CKl9、β<,1>整合素免疫组化染色鉴定FSC； 2．采用MTT法考察FSC增殖活性，流式细胞仪分析传代FSC各周期细胞的分布； 3．倒置显微镜下观察血清浓度对FSC黏附的影响，采用MTT法和细胞外LDH检测血清对FSC增殖活性的影响，比较FSC对不同浓度血清的依赖作用： 4．分离、培养人头皮来源FSC，进行CK19、整合素免疫组化染色鉴定； 5．比较FSC和ESC体外贴壁时间、贴壁率、贴壁后形态结构、生长曲线和表皮干细胞活性的差异，配对t检验分析比较FSC与ESC增殖活性的差异； 6．分离培养FB，建立FB与FSC共培养技术，采用酶化学法检测培养体系中LDH活性，间接反映成FB对FSC活性的干预作用。通过FSC形态学的改变，研究真皮来源的FB对FSC多分化潜能的影响。 结论： 1．“两步酶”法是一种高效、快速获取CK19、β1整合素阳性表达的FSC的分离方法。 2．获取的FSC具有高增殖能力，细胞均一且能够长期在体外扩增形成复层结构。 3．血清提高加强K-SFM对FSC粘附和增殖作用，FSC适宜的培养环境是含10％FBS的K-SFM。 4.与ESC相比，FSC不仅高表达β1整合素，且能较长时间在体外扩增，是一种比ESC更具优势的皮肤种子细胞。 5．真皮来源的成纤维细胞对FSC增殖具有促进作用，FSC在与真皮来源的成纤维细胞共培养的条件下可能表现出多分化潜能。研究结果提示：FSC不仅获取容易，而且具有高增殖活性和多分化潜能的特点，是一种极具潜力的组织工程皮肤种子细胞。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

主要试剂

主要实验器材及仪器

第一部分：兔触须部毛囊干细胞的研究

一、FSC的分离、培养及鉴定

二、FSC增殖活性的观察

三、血清浓度对FSC的黏附、增殖的影响

第一部分讨论

第二部分：人头皮来源毛囊干细胞的研究

一、FSC的分离、培养及鉴定

二、FSC与ESC生物学特性的比较

三、真皮来源的FB与FSC共培养的初步观察

第二部分讨论

本文主要结论

参考文献

致谢